心肌肥厚大鼠心肌組織及肥大心肌細胞中環狀RNA rno_circRNA_016002表達觀察

邱曼曼，費喬曼，武莉莉，王書影，楊冰，張玲

1 天津醫科大學基礎醫學院，天津300070；2 中國人民武裝警察部隊后勤學院

心肌肥厚是隨著心臟負荷增加而產生的一種適應性變化。生理性心肌肥厚常發生于運動員、孕婦等群體中，而長期肥厚性的刺激，如高血壓、心肌炎等將會導致病理性心肌肥厚。病理性心肌肥厚可以導致細胞外膠原蛋白沉積、腎上腺素反應喪失，并且發生代謝異常，最終導致不可逆的結構性心臟重塑、細胞死亡、心衰等癥狀［1-2］。病理性心肌肥厚將會導致心肌細胞變大、肌節結構分離、蛋白質合成增強、胎兒基因，如ANP、BNP 等將會重新表達［3］。然而，心肌肥厚的分子生物學機制目前還未被完全闡明，需要更進一步的深入研究。

環狀RNA 作為一種單鏈共價閉環遺傳上高度保守的單鏈環狀RNA，其在真核細胞中的表達具有細胞類型、組織乃至發育階段的特異性［4］。由于環狀RNA 沒有5"或3"末端，其穩定性高于線性RNA，常規核酸外切酶可將其降解。多數環狀RNA 并不具翻譯編碼蛋白質的能力，但是近期研究表明，一些環狀RNA 也參與了蛋白質的合成［5-6］。環狀RNA 可以作為吸收miRNA 的海綿，在轉錄水平和轉錄后水平起重要的調控作用。通過對心臟組織深度測序發現，在心臟組織中環狀RNA 表達相對比較豐富，并且在心臟發育的不同階段具有特異性表達，有可能成為心血管系統疾病特異性的生物標志物，但目前其在心血管領域中的研究少見［7-8］。環狀RNA rno_circRNA_016002 位 于 第 八 號 染 色 體（chr8：14833006|14966744），在高血壓大鼠模型中表達上調［9］，其在心肌肥厚的過程中是否起作用仍未可知。2019年3月—2020年6月，我們采用ISO誘導了心肌肥厚大鼠及肥大心肌細胞模型，觀察了環狀RNA rno_circRNA_016002在肥厚的心肌組織及肥大心肌細胞中的表達變化，并采用siRNA 干擾環狀RNA rno_circRNA_016002 的表達水平，觀察心肌肥厚標志物ANP 和BNP 的mRNA 和蛋白質在心肌細胞中的表達變化，以明確環狀RNA rno_circRNA_016002在心肌肥厚過程中是否起調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、試劑、儀器 SPF 級SD 大鼠，120 ～150 g/ 只，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司。H9C2細胞系購自美國ATCC，DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA 購自GIBICO 公司，蘇木與伊紅染料購自北京索萊寶公司、Western及IP 細胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自英國abcam 公司，化學發光液采用Pierce 公司ECL Western bloting Substrate，TRIzol RNA 純化試劑及Maxima Reverse Transcriptase 逆轉錄酶購自美國ThermoFisher Scientific 公司，RNase R 及BrightGreen qPCR MasterMix 購自加拿大ABM 公司。兔抗ANP單克隆抗體（abcam，ab189921），兔抗BNP 多克隆抗體（abcam，ab19645），小鼠抗GAPDH 單克隆抗體（abcam，ab8245），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司，Catalog：AS014），辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司，Catalog：AS003）超聲心動圖檢測儀購自Toronto Canada，切片機購自德國LEICA，NanoDrop 2000 微量分光光度計購自美國ThermoFisher Scientific 公司，ABI 7500 實時熒光定量PCR 系統，BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝膠成像系統，Thermo Forma 311直熱式CO2細胞培養箱。

1.2 實驗動物分組、大鼠心肌肥厚模型的建立及肥厚的心肌組織中rno_circRNA_016002的檢測

SD 大鼠適應性飼養48 h 后，分為Control 組和ISO 組，每組6 只。ISO 組每天腹腔注射ISO 3 mg/kg，Control組注射同等體積的生理鹽水，連續注射兩周后，進行超聲心動圖檢查，結果顯示ISO 組大鼠發生了心肌肥厚。之后處死大鼠，取出心臟，除去多余的組織與血管，生理鹽水灌注后進行組織包埋與切片，HE 染色顯示ISO 組心肌細胞橫截面積明顯增大，證明大鼠心肌肥厚造模成功。

肥厚的心肌組織中rno_circRNA_016002 的檢測采用實時定量PCR 法。50 mg 大鼠心肌組織（切碎后）加入至1 mL TRIzol 試劑中，按照試劑說明書進 行。circRNA 的 純化，10 μg 總RNA 采用2 μL RNase R（10 U/ μL）37 ℃消化3 h。逆轉錄采用隨機引物作為逆轉錄引物，使用Maxima Reverse Transcriptase 逆轉錄酶，按照其說明書進行。實時定量PCR 按照BrightGreen qPCR MasterMix 說明書操作。實時定量PCR 反應條件為50 ℃2 min；95 ℃5 min；95 ℃15 s，60 ℃40 s，40 個循環。采用2-ΔΔCt法計算基因mRNA 表達水平。每個樣品采用3 個復孔，實驗重復3 次。實時定量PCR 所使用引物如下：rno_circRNA_016002 上游引物為5"CGGGGATCCAACTTCCAGTG3"，下 游 引 物 為5"ACCTGCATGTGATTGCCCTAT3"；GAPDH 上游引物為5"TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC3"，下游引物為5"TTCCCATTCTCAGCCTTGAC3"。

1.3 肥大心肌細胞H9C2模型的建立、siRNA轉染及siRNA干擾的心肌細胞H9C2中ANP、BNP的檢測

1.3.1 細胞分組及肥大心肌細胞H9C2 模型的建立 心肌細胞H9C2 采用DMEM 培養基添加10%胎牛血清。在37 ℃、5%CO2與飽和濕度的條件下進行培養，每兩天換液一次，待細胞密度為80%～90%，用不含血清的培養基饑餓過夜后分為ISO 50 μmol/L組、ISO 100 μmol/L 組、細胞對照組，ISO 50 μmol/L與ISO 100 μmol/L 組中分別添加50與100 μmol/L 的ISO，細胞對照組不作處理，48 h 后收集細胞，采用1.3 中實時定量PCR 法，檢測各組ANP mRNA、BNP mRNA 及rno_circRNA_016002，發現相比于細胞對照組，ISO 50 μmol/L 與ISO 100 μmol/L 組中ANP mRNA 與BNP mRNA 的表達均升高，證明肥大細胞模型造模成功。

1.3.2 心肌細胞H9C2 siRNA轉染及分組 用焦碳酸二乙酯處理過的水將siRNA干粉溶解為20 μmol/L的儲備液。轉染試劑采用Lipofectamine RNAiMAX（美國ThermoFisher Scientific 公司）。具體操作按照轉染試劑說明書操作。si-rno_circRNA_016002 siR?NA 干擾序列為5"UUUAAAUACUAAAUUAUGC3"。將 心 肌細胞H9C2 分為siRNA+ISO 50 μmol/L 組、siRNA+ISO 100 μmol/L 組、siRNA 組、陰性對照組，其中陰性對照組中只加入轉染試劑，siRNA 組中加入siRNA 與轉染試劑，siRNA+ISO 50 μmol/L 與siR?NA+ISO 100 μmol/L 組分別用siRNA 與轉染試劑干擾后，加入50與100 μmol/L的ISO處理饑餓過夜，加入ISO 48 h 后收集細胞，siRNA 組、siRNA+ISO 50 μmol/L 組 與siRNA+ISO 100 μmol/L 組 中rno_cir?cRNA_016002 的表達水平分別為0.3367 ± 0.01、0.5967 ± 0.01、0.5067 ± 0.01，陰 性 對 照 組 中rno_circRNA_016002 的表達水平為1.125 ± 0.03。與陰性對照組相比，各組rno_circRNA_016002 的表達水平均降低（P<0.01）。說明心肌細胞H9C2 轉染成功。

1.3.3 siRNA 干擾的心肌細胞H9C2中ANP mRNA與BNP mRNA 的檢測 采用1.3 中實時定量PCR法，每組收集1×107個細胞檢測siRNA 干擾的心肌細胞H9C2 中ANP mRNA 與BNP mRNA。實時定量PCR 所使用引物如下：rno_circRNA_016002 上游引物為5"CGGGGATCCAACTTCCAGTG3"，下游引物為5"ACCTGCATGTGATTGCCCTAT3"；ANP 上游引物為5"GGATTTCAAGAACCTGCTAGA3"，下游引物為5"GCTTCATCGGTCTGCTCGC3"；BNP 上 游 引 物 為5"CTCTGGGACCACCTCTCAAG3"；下 游 引 物 為5"CAAGTTTGTGCTGGAAGATAAG3"；GAPDH 上 游引物為5"TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC3"，下游引物為5"TTCCCATTCTCAGCCTTGAC3"。

1.3.4 siRNA 干擾的心肌細胞H9C2 中ANP、BNP蛋白的檢測 采用Western blotting 法。收集3×106個細胞，用Western 及IP 細胞裂解液裂解細胞，冰浴、超聲、離心后吸取的上清即為總蛋白，采用BCA Protein Assay Kit進行蛋白定量。取等量蛋白經12%的聚丙烯酰胺電泳后采用半干轉轉移至PVDF 膜上，利用TBST 配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗GAPDH（稀釋比例1∶1 000）、ANP（稀釋比例1∶1 000）、BNP（稀釋比例1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3 次，每次10 min。二抗山羊抗兔抗體（稀釋比例1∶10 000）、山羊抗鼠抗體（稀釋比例1∶10 000）室溫孵育1 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min。采用Pierce ?ECL Western blotting Substrate檢 測，BIORAD ChemiDoc XRS 凝膠成像系統進行記錄拍照。Image J 軟件測量蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用LSD-t 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肥厚的心肌組織中rno_circRNA_016002 表達的變化 ISO 組及Control 中rno_circRNA_016002 相對表達量分別為1.703 ± 0.03、1.142 ± 0.05，兩組比較，P<0.01。

2.2 肥大心肌細胞中rno_circRNA_016002 表達的變化 ISO 50 μmol/L、ISO 100 μmol/L 組及細胞對照組中rno_circRNA_016002 的相對表達量分別為1.883±0.02、2.123±0.008、1.133±0.03；與細胞對照組相比，ISO 50 μmol/L 與ISO 100 μmol/L 組中rno_circRNA_016002的表達量均升高（P<0.01）。

2.3 siRNA 干擾的心肌細胞H9C2 中ANP mRNA、ANP 蛋白、BNP mRNA、BNP 蛋白表達的變化 與陰性對照組相比較，siRNA+ISO 50 μmol/L 組與siR?NA+ISO 100 μmol/L 組中ANP、BNP 的mRNA 與蛋白質水平差異無統計學意義（P 均>0.05）。見表1及圖1。

表1 三組ANP mRNA、ANP蛋白、BNP mRNA、BNP蛋白表達比較（X±S）

圖1 三組ANP、BNP 蛋白電泳圖

3 討論

心肌肥厚作為一種在正常生理、病理條件下，或神經激素刺激下的一種適應性反應，伴隨著心肌細胞H9C2 體積的增大、蛋白合成的增強乃至ANP、BNP等眾多嬰兒基因的重新表達［10］。長期的心肌肥厚會發展為心衰，乃至誘發死亡。近年來越來越多的研究表明，包括環狀RNA、長鏈非編碼RNA 在內的多種非編碼RNA 在包括心肌肥厚在內的多種生理或病理生理學過程中起到了重要的調控作用［11］。

circRNA 屬于ncRNA，它們由DNA 轉錄產生而不發生轉錄后翻譯。與LncRNA 不同，circRNA 是通過特定的反向剪接機制形成的共價閉合的單鏈RNA 分子［12-13］。 circRNA 的潛在功能仍然有待研究，某些circRNA 通過控制宿主基因的mRNA 表達而參與基因的調控，而另一些circRNA 則具有反式作用。 通過與miRNA/mRNA 結合競爭，它們可以充當特定miRNA 的有效海綿，或作為RBP 的誘餌，可以直接或間接調節基因表達［14-16］。由于這些潛在的作用，circRNA 被認為是重要的表觀遺傳與許多生理過程的調節劑。根據文獻中高通量測序的結果顯示，在ISO 誘導的心肌肥厚模型中，3 323 個環狀RNA 中，有401 個環狀RNA 存在差異性表達，其中303個表達水平上調，而98個表達水平下調［17］。Cir?cRNA_000203 可以通過抑制miR-26b-5P 和miR-140-3P，結合GATA4，進而促進心肌肥厚的病理過程［18］。心肌細胞中環狀RNA HRCR 表達水平的提高，可以通過在細胞質中抑制miR-233，從而減弱心肌肥厚及心衰的發生［19］。環狀RNA circslc8a1 可以作為吸收miR-133a 的內源性海綿，并且可以作為治療心肌肥厚的藥物靶點［20］。而環狀RNA circHIPK3可以通過miR-29b-3p 抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心臟纖維化。血清中的環狀RNA circTMEM56 和circDNAJC6 可以在肥厚性梗死心肌病中起到疾病進程標志物的作用［21］，然而關于環狀RNA rno_cir?cRNA_016002 在心肌肥厚中的作用尚不明確，需要更進一步的深入研究。

本研究發現，環狀RNA rno_circRNA_016002 在ISO 誘導的大鼠心肌肥厚模型過表達。H9C2 細胞在ISO 的刺激下，rno_circRNA_016002 表達水平顯著升高。采用siRNA 干擾rno_circRNA_016002表達后，ISO 刺激并不能使rno_circRNA_016002 表達水平回到陰性對照組的水平，并且心肌肥厚標志物ANP 和BNP 表達水平也未能夠在ISO 的誘導下實現表達水平的上調，說明rno_circRNA_016002 在心肌肥厚的過程中起到了重要的調控作用，抑制rno_cir?cRNA_016002 的表達可以阻止ISO 誘導的心肌肥厚過程。本研究為環狀RNA 在心肌肥厚過程中調控作用提供了新的思路和理論基礎。

綜上所述，ISO 誘導的大鼠肥厚的心肌組織和肥大心肌細胞中rno_circRNA_016002 表達水平上調，并且參與了心肌肥厚過程，為心肌肥厚的治療提供了新的靶點，然而rno_circRNA_016002 調節心肌肥厚的具體機制尚不明確，有待進一步的研究。