黃芪甲苷對非小細胞肺癌細胞A549、SPC-A1增殖凋亡的調控作用及其機制

吳安妮，袁力，邢婧，王楠

中國人民解放軍東部戰區總醫院，江蘇南京210000

肺癌是一種實體的惡性腫瘤，其發病率和致死率在眾多惡性腫瘤中都位居前列，在世界范圍內被認為是人類生命和健康的嚴重威脅［［1-2］。根據病理特征，肺癌分成了兩大類，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌是肺癌主要的一種亞型，占肺癌分型的85%左右［［3-6］。隨著基礎研究的深入和技術的進步，眾多的治療手段逐步應用于非小細胞肺癌的治療，包括手術、化療、免疫治療、放療和靶向治療等［7-8］。目前，非小細胞肺癌對化療的治療手段并不敏感，且易產生耐藥性，導致非小細胞肺癌患者的5 年生存率僅為10%～15%［9-10］。因此，新藥物的研發以及作用機制的闡明對非小細胞肺癌的治療有著重要的現實意義。

黃芪甲苷是從中藥黃芪中提取到的主要活性成分，研究發現其在抗炎、抗氧化、降糖和改善心血管疾病等方面有重要作用［11-13］。近年，人們越來越重視中藥在抗腫瘤領域的潛在價值，關于中藥抗腫瘤的研究正逐步大規模展開。已有研究表明，黃芪甲苷可有效抑制多種類型腫瘤細胞，如肝癌細胞、人神經母細胞瘤細胞、胃癌細胞等的發育，主要是通過增強體內抑制肺癌的免疫應答而發揮抗腫瘤作用［14-16］。研究發現，黃芪甲苷可以有效抑制肺癌細胞的發育［17-18］，但不同濃度條件下黃芪甲苷抗癌的活性以及確切機制有待進一步明確。本研究以非小細胞肺癌細胞A549 和SPC-A1 為體外細胞模型，研究不同劑量的黃芪甲苷對癌細胞增殖和凋亡的調控作用，探究其潛在作用機制，為黃芪甲苷的臨床抗非小細胞肺癌的應用提供新的理論依據和潛在的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑、儀器 人非小細胞肺癌細胞A549和SPC-A1均購自中國科學院上海細胞庫，體外培養于添加有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養液中，在37 ℃、5% CO2的孵育箱內培養。黃芪甲苷（上海源葉生物），用二甲基亞砜（DMSO，Sigma）溶解配成10 mmol/L 的原藥貯存液，存于4 ℃冰箱中備用。苯甲基磺酰氟，蛋白酶抑制劑混合液、蛋白磷酸酶抑制劑混合液、高效RIPA 裂解液（上海碧云天公司），一抗兔抗多克隆anti-Ki67、兔抗多克隆anti-PCNA、兔抗多克隆anti-phosopho-Akt（Ser473）、鼠抗單克隆anti-Akt，二抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG（北京博奧森公司），兔抗多克隆anti-Cleaved caspase9（ASP315）、兔 抗 多 克 隆anti-Cleaved caspase3（Asp175）（美 國Affinity 公 司）。MTT 試劑盒（北京索萊寶），TUNEL 試劑盒（瑞士Roche 公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天）。多功能酶標儀（美國Biotek 公司），流式細胞儀（美國BD 公司），全自動熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）。

1.2 不同濃度的黃芪甲苷加入后A549 和SPC-A1細胞生長抑制率的測算 采用MTT 法。取對數生長期的A549和SPC-A1細胞，用胰酶進行消化處理，而后用含10%胎牛血清RPMI-1640培養液制備細胞懸液，細胞密度為1×105個/mL。吸取細胞懸液接種到96 孔板中，每孔200 μL。然后將96 孔板放置在37 ℃、5% CO2孵育箱中培養24 h。等到細胞貼壁后，加入0、10、20、40、60、80、100 μmoL/L 的黃芪甲苷替換掉培養液并繼續培養24 h。黃芪甲苷處理后，用PBS 進行洗滌，洗滌后加入100 μL 的培養液和20 μL MTT（5 mg/mL），4 h 后終止培養，棄上清液。最后，往每孔中加入150 μL 的DMSO，并將96孔板放置在水平搖床上振蕩10 min，在酶標儀上測定490 nm 波長的吸光值（OD）。按下列公式計算生長抑制率：生長抑制率=（1–加藥組平均OD 值/對照組平均OD 值）×100%。計算出加入24 h 時黃芪甲苷對A549和SPC-A1細胞增殖的半數抑制濃度（IC50）。

1.3 IC50 的黃芪甲苷加入后A549 和SPC-A1 細胞凋亡率的測算 采用TUNEL 法。取對數生長期的A549和SPC-A1細胞，制備細胞懸液后，按照每孔中1×105個細胞接種到6 孔板中，并放置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養24 h 后分為黃芪甲苷組和空白對照組，等到細胞貼壁后，棄掉培養液，黃芪甲苷組加入IC50 濃度的黃芪甲苷繼續培養24 h，隨后收集細胞，用PBS 洗滌1 次，再用1 500 r/s 的轉速對細胞懸液進行離心5 min，棄上清液。接著加入4%多聚甲醛固定細胞，而后置于搖床上緩慢搖動1 h。最后，用含0.1% Triton X-100 的PBS 重懸細胞，并在冰上孵育2 min，再按照TUNEL 試劑盒說明書采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4 IC50 的黃芪甲苷加入后A549 和SPC-A1 細胞中Ki67、PCNA、Caspase-3、Caspase-9 mRNA 的 檢測 采用熒光定量PCR（qRT-PCR）法。將A549 和SPC-A1細胞分為黃芪甲苷組及空白對照組，黃芪甲苷組加入IC50 的黃芪甲苷，空白對照組不加黃芪甲苷，培養24 h后，分別收集各組細胞。利用TRIzol試劑提取細胞的總RNA，利用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，接著用實時定量PCR 法檢測Ki67、PCNA、Caspase-3 和Caspase-9。Ki67 上游引物：5"-GCAGGACTTCACTTGCTTCC-3"，下 游 引 物：5"-TCATTTGCGTTTGTTTCACG-3"；PCNA 上游引物：5"-AAGGGCTGAAGATAATGCT-3"，下 游 引物：5"-AT?CACCACAGCATCTCCAAT-3；"Caspase-3 上游引物：5"-GGAACGAACGGACCTGTG-3"，下 游 引 物：5"-GCCTCCACTGGTATCTTCTG-3"；Caspase-9 上 游 引物：5"-AAGCCAACCCTAGAAAACATTACC-3"；下游引 物：5"-GACATCACCAAATCCTCCAGAAC-3"；GAPDH 上 游 引 物：5"-CTCCTCCTGTTCGACAGT?CAGC-3"，5"-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3"。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表達水平。

1.5 IC50 的黃芪甲苷加入后A549 和SPC-A1 細胞Cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、t-Akt、p-Akt 蛋白的檢測 采用Western blotting 法。將對數生長期的細胞分別接種于6 孔培養板中（約2×105個/孔），用IC50 的黃芪甲苷（黃芪甲苷組）處理，同時設立空白對照組，處理24 h 時用RIPA 蛋白裂解液（Beyotime）裂解細胞并提取蛋白，接著用BCA 蛋白定量法對提取的總蛋白進行定量。分別取各組60 ng 總蛋白上樣，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE 分析，并將蛋白轉移到PVDF 膜上。用TBST 洗滌帶有蛋白條帶的PVDF 膜后，用5%的馬血清室溫封閉膜30 min，然后與TBST 中稀釋的特異性初級抗體在4 ℃孵育過夜。一抗結束后，用TBST 洗滌2～3 次，每次10 min，隨后用二次抗體室溫孵育膜2 h。用ECL 發光試劑盒，將所得蛋白進行熒光自顯影。用凝膠成像系統記錄蛋白電泳條帶，利用Image J 軟件測量其灰度值，以目的蛋白與內參的灰度值的比值代表目的蛋白的半定量值（將對照組目的蛋白的灰度值與內參的比值設為1）。實驗重復3 次，取平均值。

1.6 統計學方法 采用GraphPad Prism 5.0 軟件。計量資料以表示，比較采用t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度黃芪甲苷加入后24 h A549、SPC-A1細胞的存活率 不同濃度的黃芪甲苷加入后，A549、SPC-A1細胞的增殖活性均隨著黃芪甲苷濃度的升高而逐步降低（圖1）。0、10、20、40、60、80 以及100 μmol/L 的黃芪甲苷作用后24 h，A549 細胞的存活 率 分 別100.47% ± 5.37%、88.53% ± 4.22%、73.83% ± 4.93%、37.63% ± 4.73%、26.20% ±5.52%、13.05% ± 3.47%、5.48% ± 2.79%；SPC-A1細胞的存活率分別為102.23% ± 5.75%、94.58% ±4.06%、65.73% ± 3.40%、42.64% ± 6.14%、22.72% ± 4.10%、12.66% ± 5.05%、4.63% ±2.17%。不同濃度的黃芪甲苷加入后，A549 和SPCA1 細胞活力均明顯下降（t=3.434，P<0.05）。根據細胞增值活性曲線，計算出黃芪甲苷處理后24 h，A549 和SPC-A1 細胞增殖的半數抑制濃度（IC50）分別為32.6 μmol/L和29.4 μmol/L。

圖1 不同濃度黃芪甲苷作用后A549細胞的增殖活性曲線

圖2 不同濃度黃芪甲苷作用后SPC-A1細胞的增殖活性曲線

2.2 IC50的黃芪甲苷加入后，A549 和SPC-A1細胞凋亡率 IC50 的黃芪甲苷加入后24 h，A549 細胞凋亡率：黃芪甲苷組為29.08% ± 2.49%，空白對照組為8.80% ± 1.47%；，兩組比較，t=12.58，P<0.05；SPC-A-1 細胞凋亡率：黃芪甲苷組為25.55% ±2.56%，空白對照組為6.11%±0.88%，兩組比較，t=12.44，P<0.05。

2.3 IC50 的黃芪甲苷加入后肺癌細胞A549、SPCA-1 中Ki67、PCNA、Caspase-3、Caspase-9 基因的表達 在A549細胞中，黃芪甲苷組中Ki67 mRNA、PC?NA mRNA、Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA 相對表達量分別為0.727±0.133、0.363±0.090、1.579±0.191、2.052±0.151，空白對照組為1。與空白對照組比較，黃芪甲苷組Ki67 mRNA、PCNA mRNA 相對表達量降低，Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA相對表 達 量 升高（t 分別為3.51、10.82、4.875、12.08，P 均<0.05）。SPC-A-1 細胞中，黃芪甲苷組中的Ki67 mRNA、PCNA mRNA、Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA 相對表達量分別為0.527±0.043、0.483 ± 0.076、1.287 ± 0.162、1.752 ± 0.171，空白對照組為1。與空白對照組比較，黃芪甲苷組Ki67 mRNA、PCNA mRNA 相對表達量降低，Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA 相對表達量升高（t 分別為19.07、8.591、2.965、7.565，P均<0.05）。

2.4 黃芪甲苷加入后，非小細胞肺癌細胞Cleaved?caspase3、Cleaved-caspase9、t-Akt、p-Akt 蛋 白 表 達非小細胞肺癌細胞A549 中Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、t-Akt、p-Akt 分 別 為0.845 ±0.136、1.467 ± 0.123、0.902 ± 0.071、0.474 ±0.039。 非小細胞肺癌細胞SPC-A1 中，Cleavedcaspase3、Cleaved-caspase9、t-Akt、p-Akt 分 別 為0.924 ± 0.156、1.578 ± 0.135、1.036 ± 0.052、0.635±0.072。在非小細胞肺癌細胞A549中，與空白對照組比較，黃芪甲苷組Cleaved-caspase3 和Cleaved-caspase9 的蛋白表達量均增加（t 分別為11.110 和5.423，P 均<0.05），p-Akt 降低（t=16.93，P<0.05），t-Akt 差異無統計學意義（t=1.549，P>0.05）。在非小細胞肺癌細胞SPC-A1 中，與空白對照組比較，黃芪甲苷組Cleaved-caspase3 和Cleavedcaspase9 的蛋白表達量均增加（t 分別為10.180、7.418，P<0.05），p-Akt 降低（t=9.025，P均<0.05），t-Akt差異無統計學意義（t=1.478，P>0.05）。

3 討論

肺癌是全球范圍內公認的發病率和致死率最高的惡性腫瘤之一。非小細胞肺癌患者的5年生存率不高，因而研究新型抗腫瘤藥物用于治療非小細胞肺癌具有非常重要的現實意義。中藥黃芪提取物中含有一種主要的活性成分——黃芪甲苷，研究表明黃芪甲苷在抗炎、抗氧化、降糖和改善心血管疾病等方面扮演了重要的角色［11-13］；同時，近期研究表明，黃芪甲苷在抗腫瘤方面也具有顯著性的抑制作用［15-16，18］，黃芪甲苷可能作用的信號通路是Wnt/βcatenin 信號通路［19］。黃芪甲苷抑制卵巢癌SKOV3細胞的體外增殖和遷移、侵襲能力，可能與其下調MMP2、MMP9 蛋白的表達有關［20］。目前，黃芪甲苷對非小細胞肺癌細胞的調控作用還不十分明確，作用機制還有待深入探究。本研究中，首先我們利用MTT 分析了不同劑量的黃芪甲苷對A549 和SPC-A1細胞增殖活性的影響，確定了黃芪甲苷處理后24 h的IC50 分別為32.6 μmol/L（A549 細胞）和29.4 μmol/L（SPC-A1 細胞），明確了黃芪甲苷對A549 和SPC-A1 細胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性。同時，我們利用TUNEL 法檢測了黃芪甲苷對A549 和SPC-A1 細胞凋亡的調控作用，研究發現，黃芪甲苷可促使A549和SPC-A1細胞凋亡。為了進一步確認黃芪甲苷抑制A549 和SPC-A1 細胞的增殖，促進其凋亡，我們還檢測了增殖相關基因Ki67、PCNA 和凋亡相關基因caspase-3、caspasse-9的mRNA 和蛋白的表達量。研究發現，在黃芪甲苷處理的細胞中，Ki67和PCNA 的表達水平有顯著性下降；而caspase-3 和caspasse-9的表達水平則是顯著性上調，進一步表明黃芪甲苷可以抑制A549 和SPC-A1 細胞的增殖，促進A549和SPC-A1細胞的凋亡。

Akt 信號通路是調控細胞增殖和生長的關鍵信號通路，PI3K在Akt的上游，生長因子可以通過激活PI3K 信號轉導通路誘導Akt 激活為磷酸化狀態，即p-Akt，來調控細胞增殖。已有相關研究結果顯示，黃芪甲苷通過抑制PI3K/AKT 信號通路，抑制DNA損傷修復，誘導肝癌細胞凋亡，使細胞周期G2/M 期發生阻滯，可以使細胞微核率增加，發揮對肝癌細胞的放射增敏作用［21］。本研究中，我們通過免疫印跡法檢測了t-Akt 以及p-Akt 的表達水平，發現在黃芪甲苷處理后的A549 和SPC-A1 細胞中，t-Akt 的表達沒有發生明顯的改變，而p-Akt 的表達水平有顯著性的下降，提示黃芪甲苷對A549 和SPC-A1 細胞的增殖和凋亡的調控作用可能由Akt 信號通路介導的。

綜上所述，黃芪甲苷可以抑制非小細胞肺癌細胞A549 和SPC-A1 的增殖，促進A549 和SPC-A1 的凋亡，且調控作用具有劑量依賴性。黃芪甲苷對A549 和SPC-A1 細胞的增殖和凋亡調控作用可能是通過抑制Akt信號通路中p-Akt的表達量來實現的，這將為非小細胞肺癌的治療提供新的理論依據和潛在作用靶點。本課題組將進一步針對黃芪甲苷對Akt 信號通路的下游機制進行驗證并探討黃芪甲苷治療非小細胞肺癌的潛在通路。