食管鱗狀細胞癌組織中IRAIN 的表達變化及啟動子甲基化狀態觀察

鄧鎮生，林青，田作春，李才，許靜紅

三亞中心醫院，海南三亞572000

表觀遺傳學是影響食管癌發生、發展的重要因 素之一［1］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）雖然本身并不編碼蛋白分子，但是可以通過表觀遺傳學改變、轉錄調控、轉錄后調控等影響腫瘤相關基因的表達［2］。胰島素樣生長因子1 受體長鏈非編碼RNA（IRAIN）（美國國立生物信息中心基因庫Gene ID：104472848）是已知的具有反式調節作用的Ln?cRNA，在胰腺癌［3］、非小細胞肺癌［4］和乳腺癌［5］等惡性腫瘤中表達下調。IGF-1/IGF-1R 信號通路是調控食管癌細胞增殖、遷移、侵襲等的重要途徑之一［6］，而作為IGF-1R 的反義轉錄基因，IRAIN 可競爭性抑制腫瘤細胞中IGF1R 的表達，故推測IRAIN 在食管癌中可能也發揮著重要作用。此外，通過檢索基因序列，我們發現IRAIN 啟動子存在CpG 島，其表觀遺傳學改變是否是影響該基因活性的重要原因目前仍未見報道。本研究中我們探討了食管鱗狀細胞癌（ESCC）組織和癌旁正常組織中IRAIN 的表達以及啟動子甲基化狀態差異，并探討了ESCC 組織中IRAIN 的啟動子甲基化狀態與患者臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018 年5 月-2020 年5 月于三亞市中心醫院心胸外科經手術切除的ESCC 患者63例，男38 例、女25 例，年齡37.0～71.0 歲、中位年齡56.0 歲。依據國際抗癌聯盟（UICC）與美國癌癥聯合會（AJCC）發布的第八版食管癌TNM 分期系統［7］對患者進行腫瘤分期：Ⅰ期9 例（14.29%）、Ⅱ期28例（44.44%）、Ⅲ期22 例（34.92%）、Ⅳ期4 例（6.35%）。手術中取原發性ESCC 腫瘤組織和相匹配的鄰近（距離腫瘤灶邊緣≥3 cm）食道正常黏膜組織，一部分制作蠟塊，另一部分立即放入-80 ℃保存備用。術前均未接受任何新輔助治療，且在入組前簽署知情同意書。

1.2 ESCC 組織及癌旁組織中IRAIN 的檢測 采用QPCR 法。術中獲取患者新鮮腫瘤組織及癌旁組織，分別各取100 μg，勻漿后，加入Trizol 試劑提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 試劑盒配制逆轉錄反應體系，37 ℃15 min（逆轉錄反應），85 ℃5 s（酶失活反應），得到cDNA。采用SYBR Green 熒光染料摻入法進行PCR 擴增，預變性階段：95 ℃3 min；熱循環階段：95 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃40 s，32 個循環；熔解曲線：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。IRAIN：PCR 上游引物：5‘GAAGTCTG?GCTCCGGAGGAGGGTC3’；下 游 引 物5‘ATGTG?GAGGTAGCCCTCGATCAC3’。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達量，內參為GAPDH。2-ΔΔCt≤1.0為低表達，2-ΔΔCt>1.0為高表達。·

1.3 ESCC 組織及癌旁組織中IRAIN 啟動子甲基化率的測算 采用MSP 法。術中獲取患者新鮮腫瘤組織及癌旁組織，分別各取100 μg，勻漿后，采用QIAamp DNA Mini Kit 試劑盒提取組織DNA。將獲取的DNA置于-20 ℃保存備用。采用核酸定量儀檢測DNA 含量和純度，A260/A280為1.60～1.90，說明樣本純度較高。取2 μg DNA 樣本，利用瓊脂糖凝膠電泳證實電泳條帶清晰，說明DNA 完整度良好。采用EZ DNA 甲基化試劑盒對DNA 樣本進行亞硫酸鹽修飾。將修飾后的DNA 進行PCR 擴增反應。PCR 的反應條件設定為：97 ℃2 min，1 個循環；97 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃30 s，40個循環后72 ℃10 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。IRAIN 啟動子甲基化上游引物：5′TCGGGGGATGGAGGGGTATTAGGGT3′，下 游 引 物：5′CCCGACACCACCAAAACAAAAAC?TATC3′；未甲基化上游引物：5′TTGGGGGATG?GAGGGGTATTAGGGT3′，下游引物5′CCCAACAC?CACCAAAACAAAAACTATC3′。MSP 結果判讀：完全甲基化：甲基化特異引物擴增出目的條帶，而非甲基化特異引物沒有擴增出目的條帶；部分甲基化：甲基化特異引物和非甲基化特異引物均擴增出目的條帶；非甲基化：非甲基化特異引物擴增出目的條帶，而甲基化特異引物沒有擴增出目的條帶。我們將完全甲基化與部分甲基化均按甲基化統計。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料以表示，比較采用t 檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗或McNemarχ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCC 組織及癌旁正常組織中IRAIN 表達及啟動子甲基化率比較 ESCC 組織和癌旁正常組織中IRAIN 表 達 量 分 別 為0.816 ± 0.286、1.000 ±0.185，兩者比較，t=4.288，P=0.000。ESCC 組織和癌旁正常組織中IRAIN 啟動子甲基化率分別為58.73%（37/63）和19.05%（12/63），兩者比較，χ2=20.872，P=0.000。ESCC 組織中IRAIN 啟動子甲基化以部分甲基化為主，見圖1。

2.2 不同啟動子甲基化狀態ESCC組織中IRAIN表達比較 IRAIN 啟動子甲基化和非甲基化ESCC 組織IRAIN 相對表達量分別為0.661 ± 0.256、1.037± 0.149，IRAIN 高表達分別為6（16.22%）、16 例（61.54%）。兩組IRAIN 相對表達量比較，t=6.722，P<0.05；RAIN高表達率比較，χ2=13.802，P<0.05。

圖1 ESCC組織及癌旁正常組織中IRAIN的啟動子甲基化狀態電泳圖

2.3 ESCC 組織中HOTAIR 啟動子甲基化狀態與患者臨床病理參數的關系 ESCC 組織中IRAIN 啟動子甲基化狀態與患者腫瘤最大直徑、TNM 分期、淋巴結轉移有關（χ2分別為13.607、25.581、5.039，P均<0.05），但是與患者年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、脈管侵犯、神經侵犯無關（χ2分別為1.021、0.128、0.019、3.147、0.524、2.423，P 均>0.05），詳見表1。

3 討論

近年隨著轉錄組學的深入研究和生物信息學技術的發展，ESCC 的惡性進展機制已取得了不少進步，多數研究不止關注蛋白編碼RNA，越來越多的非編碼RNA 被發現，且被證實在表觀遺傳調控、基因轉錄，轉錄后調節和蛋白質的翻譯后修飾等過程中都發揮著關鍵作用［8］。LncRNAs 是一類長度超過200 nt 的非編碼RNAs，與小分子RNA 相比數量多、種類多、作用模式多樣［9］，作為潛在的抑癌基因或癌基因，逐漸引起眾多學者的關注。

根據基因組定位和作用方式，LncRNAs 可分為基 因 內LncRNAs、基 因 間LncRNAs、增 強 子Ln?cRNAs、有義重疊LncRNAs和雙向LncRNAs［10］，其中有義重疊LncRNAs 即在DNA 的有義鏈中與一個或多個不同蛋白質編碼基因的內含子和外顯子重疊，包括正義重疊LncRNAs、反義重疊LncRNAs。IRAIN 是近年新發現的一類反義重疊LncRNA，其轉錄方向與IGF-1R 編碼基因相反［11］。KANG 等［5］已經證實，IRAIN 表達均來自于父源等位基因，屬于IGF-1R 父源印跡基因。IGF-1R 是由2 個α 亞基和2個β 亞基組成的四聚體結構跨膜酪氨酸激酶受體，其同源配體為IGF-1 和IGF-2。IGF-1R/IGF-1/2 軸為絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶/雷帕霉素靶蛋白通路和磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B 通路的上游途徑，因此IGF-1R 是維持眾多腫瘤細胞惡性表型的關鍵分子之一。張俊凱等［12-13］均證實IGF-1R 蛋白在食管癌組織中表達量顯著上調，并且通過小RNA 干擾技術沉默IGF-1R 基因表達后，食管鱗癌細胞EC-9706 的增殖能力顯著降低。本研究中，我們通過免疫組化染色法也證實，IGF-1R 蛋白在ESCC組織中的陽性表達率高于癌旁正常組織，因此認為IGF-1R 可能是ESCC 進展的先決條件，有望成為食管癌臨床治療的干預靶點。

表1 ESCC組織中IRAIN啟動子甲基化狀態與患者臨床病理參數的關系（例）

本研究中我們通過QPCR 法證實，ESCC 組織中作為IGF-1R 反義轉錄的印跡基因的IRAIN 表達水平低于癌旁正常組織，并且與患者腫瘤最大直徑、TNM 分期、淋巴結轉移有關，故推測IRAIN 在ESCC惡性化進程中可能具有抑癌基因的活性，與在肝癌、喉鱗癌等樣本中的檢測結果一致。趙炎斌等［14］證實IRAIN 在肝癌組織中的表達水平降低，且與肝癌的惡性程度等病理特征有關。王健艷等［15］則通過對gDNA 測序IRAIN SNP 位點（rs8034564）為雜合子的喉癌患者進行cDNA 測序，證實IRAIN 在喉癌組織、癌旁組織和正常咽部黏膜中均呈雙等位基因表達，而且IRAIN在喉癌組織和癌旁組織中的等位基因存在不平衡表達，但是在正常咽部黏膜中不存在不平衡表達，且喉癌組織中IRAIN 表達量低于正常咽部黏膜和癌旁組織；說明IRAIN對于肝癌、喉癌等惡性腫瘤的生長也有一定的抑制活性。表觀遺傳學修飾是眾多LncRNA 遺傳印記常見的調控機制，這可能與印記基因的印記控制區不穩定有關。在本研究中，我們發現IRAIN同樣存在啟動子甲基化狀態，且ESCC 組織中IRAIN 啟動子甲基化率高于癌旁正常組織，這可能是ESCC組織中IRAIN表達量降低的重要機制之一。

綜上所述，IRAIN 在ESCC 組織中的表達量降低，可能與其啟動子甲基化狀態有關；隨著ESCC 惡性化進展，IRAIN 啟動子甲基化率也逐漸升高，因此IRAIN 有望成為將來ESCC 基因治療的新靶點。但是由于我們對于LncRNAs 的研究仍處于起步階段，而且現有的技術手段有限，因此對于LncRNAs 的認識和研究還很膚淺，例如IRAIN 如何調控正義轉錄物IGF-1R 表達；作為單等位基因，IRAIN 等位基因的不平衡表達是否與不編碼功能有關等都將成為日后研究的重點。