甲狀腺癌組織中泛素羧基端水解酶5的表達觀察

張小麗，海濤，劉文清，李非

首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，北京100053

甲狀腺癌是最常見的頭頸部和內分泌系統惡性腫瘤，2018 年全球新發(fā)病例約為56.7 萬例，中國2016 年甲狀腺癌發(fā)病率、病死率分別為3.1/10 萬、0.4/10 萬［1-2］。根據病理類型甲狀腺癌可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌，其中乳頭狀癌約占90%［3］。早期手術切除聯合術后TSH 抑制治療是臨床治療甲狀腺癌最常見的手段，除未分化癌和髓樣癌5 年生存率較差以外，其余類型甲狀腺癌大部分患者預后均較好，5年生存率可超過90%［4］。但是，部分甲狀腺癌患者確診時惡性腫瘤已侵襲周圍組織并發(fā)生遠處轉移，進而導致患者預后不良及術后復發(fā)。目前，臨床診斷甲狀腺癌主要通過甲狀腺超聲檢查、針吸細胞學等手段，但是假陰性率較高［5］。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，尋找有效的分子腫瘤標志物輔助臨床診斷惡性腫瘤及判斷病情成為研究熱點。泛素羧基端水解酶5（UCHL5）是位于26S 蛋白酶體19S 調節(jié)亞基上的泛素羧基末端水解酶異構體，主要調控人體中蛋白質的泛素化，參與蛋白質的代謝、功能、調節(jié)、降解等過程［6］。研究顯示，UCHL5 表達上調參與了卵巢癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)病過程，并與病情進展密切相關［7-8］。關于UCHL5 與甲狀腺癌的關系，相關研究報道相對較少。本研究檢測了甲狀腺癌組織中UCHL5 表達水平，并探討了其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014 年6 月-2017 年6 月首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院收治的92 例甲狀腺癌患者為研究對象。納入標準：①影像學檢查結合術后組織標本病理活檢證實為原發(fā)性甲狀腺癌，并符合《2010年版甲狀腺腫瘤治療指南》［9］診斷標準；②首次確診并初次手術治療的患者，手術均由本院同一團隊完成；③術前患者未接受過任何放、化學治療；④預計生存時間>6 個月者，術后均進行常規(guī)規(guī)范治療；⑤年齡18～75 歲者；⑥臨床病歷資料完整且配合隨訪的患者。排除標準：①妊娠期及哺乳期的女性患者；②合并其他甲狀腺疾病的患者；③合并其他分泌性疾病的患者；④手術禁忌證患者；⑤合并其他惡性腫瘤的患者。取手術切除的甲狀腺癌組織為甲狀腺癌組，同一患者的癌旁組織（距癌灶邊緣>5 cm）為癌旁組。本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 組織中UCHL5 的檢測 術后利用RNAiso Plus（購自于日本TaKaRa 公司）提取手術切除的新鮮病理癌組織及癌旁正常組織標本中的總RNA，操作過程參照說明書進行，紫外分光光度法檢測RNA濃度和純度，當OD260/280在1.92.1 范圍內提示RNA純度較高，可以進行下一步的反轉錄，采用無核酸酶水將1 μg RNA 稀釋至1 mL，采用SYBR Premix Ex Tap II Kit 反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）將cRNA 反轉錄合成為cDNA。采用7500 熒光定量PCR 儀（購自于Applied Biosystems 公司）檢測UCHL5 mRNA 表達水平，首先以cDNA 為模板進行擴增，上游引物序列：5’-TTCGATGTCTCTAGGGTG?GC-3’，下游引物序列：5’-GATCCACCTCTCGCTCT?CAG-3’，長度為114 bp；β-Actin為內參，上游引物序列：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物序列：5’-CTAAGTC ATAGTCCGCCTAGAA-3’，長度為51 bp。上述引物序列由上海生工公司合成。RTqPCR 反應體系為20 μL：其中10 μL 的SYBR Green Mix，分別有0.8 μL 的正向引物和反向引物，0.4 μL的Rox，1 μL 的cDNA，7 μL 的RNase-free 無酶蒸餾水。反應條件：95 ℃預變性、持續(xù)時間30 s，95 ℃變性、持續(xù)時間5 s，60 ℃退火、持續(xù)時間30 s，共計循環(huán)40 次；溶解階段：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。UCHL5表達量以2-ΔΔCT表示。

1.3 隨訪 采用門診復查方式對術后患者進行隨訪，隨訪內容包括術后B 超、CT 等影像學檢查，術后1 年每3 個月隨訪一次，1 年后每半年隨訪一次。隨訪截至2020 年6 月，隨訪時間3～6（4.28 ± 1.07）年。隨訪終點為經B 超或CT 等影像學檢查診斷為甲狀腺癌復發(fā)或轉移；無瘤生存時間是指手術切除后，體內無腫瘤病灶，直至腫瘤復發(fā)、轉移、死亡的時間。

2 結果

2.1 甲狀腺癌組織及癌旁組織中UCHL5 mRNA 相對表達量比較 甲狀腺癌組織中UCHL5 mRNA 相對表達量為0.137 ± 0.052，癌旁組織中UCHL5 mRNA 相對表達量為0.086±0.045，甲狀腺癌組織中UCHL5 mRNA 相對表達量高于癌旁組織（t=3.926，P<0.05）。

2.2 甲狀腺癌組織中UCHL5 mRNA 與患者臨床病理參數的關系 腫瘤直徑>2 cm、AJCC 分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的甲狀腺癌患者病灶組織中UCHL5 表達水平高于腫瘤直徑≤0.8 cm、Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的甲狀腺癌患者（t 分別為3.093、4.695、3.409，P 均<0.05）；不同性別、年齡、病理類型甲狀腺癌患者病灶組織中UCHL5 表達水平差異無統計學意義（t 分別為1.782、1.876、0.702，P 均>0.05）。甲狀腺癌組織中UCHL5 mRAN 與患者臨床病理參數的關系見表1。

表1 甲狀腺癌組織中UCHL5 mRAN與患者臨床病理參數的關系

2.3 甲狀腺癌組織UCHL5 表達與患者預后的關系 以甲狀腺癌患者病灶組織中UCHL5 表達水平的中位數（0.132）為臨界值，將患者分為UCHL5 高表達患者（n=38）和低表達患者（n=54），UCHL5 高表達 患 者1、2、3 年 復 發(fā) 分 別 為5（13.16%）、17（44.74%）、22 例（57.89%），UCHL5 低表達患者1、2、3 年復發(fā)分別為8（14.81%）、13（24.07%）、19 例（35.19%）；UCHL5高表達患者2年、3年復發(fā)率高于UCHL5 低表達患者（P 均<0.05），UCHL5 高表達和低表達患者1 年復發(fā)率比較，P>0.05。UCHL5 高表達患者無瘤中位生存時間為29.6 個月（95%CI：28.0～31.2），UCHL5 低表達患者無瘤中位生存時間為32.8 個月（95%CI：30.9～34.7），UCHL5 高表達患者無瘤中位生存時間少于UCHL5 低表達患者（P<0.05）。UCHL5 高表達和低表達患者生存曲線見圖1。

3 討論

圖1 UCHL5高表達和低表達患者生存曲線

甲狀腺癌約占全身惡性腫瘤的1%，雖然在我國的發(fā)病率較歐美國家低，但是仍以每年4%的速度增長，絕對死亡人數不斷上升，嚴重威脅患者健康和生命質量［10］。甲狀腺癌發(fā)病初期無特異性臨床癥狀和體征，大部分患者確診時已近中晚期，出現了腫瘤侵襲周圍組織和局部淋巴結轉移［11］。尋找有效手段早期診斷甲狀腺癌并評估病情進展，對臨床制定針對性治療措施改善患者預后、延長生存時間具有重要價值。

泛素化是指在泛素激活酶、降解酶、結合酶等作用下，泛素將細胞內的蛋白質分類并選出靶蛋白分子進行特異性修飾的過程，泛素化參與調控蛋白質代謝、調節(jié)和降解過程，以及細胞增殖、分化、凋亡、信號轉導、炎癥免疫、心血管疾病、惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理生理活動［12］。去泛素化則是在去泛素化酶的介導下降低底物蛋白的多聚泛素化，屬于蛋白翻譯后的修飾過程。泛素C 末端水解酶為去泛素化酶，可水解多聚泛素鏈成為游離的泛素單體，加速泛素鏈的解聚以及泛素的循環(huán)，同時還能使泛素化逆轉［13］。UCHL5是由223個氨基酸組成的相對分子質量約為24.8 kD 的泛素C 末端水解酶異構體，通過調控蛋白質的泛素化參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［14］。丁芳等［15］研究顯示，乳腺癌裸鼠模型組織中UCHL5 表達上調，并且與總生存時間、無復發(fā)生存時間呈負相關，敲低UCHL5表達可抑制惡性腫瘤細胞增殖并促進其凋亡。研究顯示，UCHL5 在結直腸癌、胰腺導管腺癌中表達下降，并且降低越顯著，其預后越差［16-17］。此外，UCHL5 還介導了胃癌［18］等惡性腫瘤的發(fā)病過程，并與臨床病理特征密切相關。上述研究證實，檢測UCHL5的表達可反映惡性腫瘤的進展和患者預后情況，并可作為評估治療效果的靶向指標。

本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中UCHL5相對表達量高于癌旁組織，提示UCHL5表達上調參與了甲狀腺癌發(fā)病過程。B-Raf 原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（BRAF）為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因家族成員，在甲狀腺癌中的突變率為77.8%，該基因的外顯子V600E 突變可增強BRAF 活性，進而導致甲狀腺癌發(fā)生，UCHL5表達上升可促進BARF表達，進而誘發(fā)甲狀腺癌［19］。此外，UCHL5 通過影響泛素-蛋白酶系統的降解而上調β-catenin 表達，可誘導激活腫瘤基因如cyclinD、c-Jun、c-myc 等促使肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等的發(fā)生，UCHL5 參與甲狀腺癌的發(fā)病過程可能與上述機制有關，但是有待進一步研究。臨床通過評估腫瘤分期、淋巴結轉移及浸潤等病理特征可判斷病情的進展，同時也能預測患者預后。任力等［20］的研究表明，肺癌患者UCHL5表達越高，腫瘤分化越差。本研究顯示，腫瘤直徑>2 cm，AJCC 分期III～IV 期及有淋巴結轉移的患者UCHL5表達水平明顯高于腫瘤直徑≤2 cm、I～II 期、無淋巴結轉移的患者，提示UCHL5與甲狀腺癌患者臨床病理特征密切相關，可能參與了甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程。進一步研究顯示，UCHL5 高表達患者2 年、3 年復發(fā)率高于低表達患者，生存分析結果顯示，UCHL5 高表達患者無瘤中位生存時間少于低表達患者，表明組織中UCHL5表達與甲狀腺癌患者預后有關，UCHL5 相對表達量越高則甲狀腺癌患者預后越差，復發(fā)率越高，無瘤生存時間越短。因此，早期檢測甲狀腺癌病灶組織中UCHL5 表達水平有可能可輔助預測患者預后。

綜上所述，UCHL5 表達上調參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，并與甲狀腺癌的腫瘤直徑、AJCC 分期、是否淋巴結轉移及預后密切相關。本研究為單中心回顧性研究，樣本量相對較小，同時未考慮更多可能影響患者預后的因素如手術方式、患者術后用藥等，因此所得結論尚需進一步驗證，相關機制有待基礎研究予以證實。