miR-29c和NASP在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)、對后者生物學(xué)行為影響及靶向關(guān)系預(yù)測驗(yàn)證

王方煒，李超乾

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣西南寧532000

肺癌是常見的一種腫瘤，因其高發(fā)病率和病死率受到人們的關(guān)注。非小細(xì)胞型肺癌是最常見的肺癌，大多數(shù)患者發(fā)病時已在晚期，錯過了治療機(jī)會，因此闡明肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的分子標(biāo)志物具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的小非編碼RNA，在調(diào)控細(xì)胞的分化、生長和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用［1-3］，miR-29c 屬于miR-29 家族的成員，有研究指出，miR-29c 在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，過表達(dá)miR-29c 可抑制肺癌細(xì)胞的增殖遷移、侵襲能力［4-7］，但其具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。細(xì)胞核自身抗原精子蛋白（NASP）是一種組蛋白伴侶，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究提出，敲低NASP 可抑制胃癌細(xì)胞的增殖遷移、侵襲能力，但NASP 是否在非小細(xì)胞型肺癌中發(fā)揮作用尚不清楚，并且mir-29c是否通過靶向作用于NASP 從而調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為目前尚未見報道。2019 年12 月—2020 年6 月，我們觀察了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 中miR-29c、NASP 的表達(dá)變化，探討了二者對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549增殖遷移侵襲和凋亡的影響，并驗(yàn)證了二者之間的靶向關(guān)系，為肺癌的早期診治提供了新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、慢病毒、試劑、儀器 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 和人正常肺上皮細(xì)胞HBE 均購自ATCC，細(xì)胞均用含有10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。慢病毒購自吉凱；BCA 蛋白定量試劑盒、TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于TaKaRa 公司；CCK8 試劑、Transwell 小室、基質(zhì)膠、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Sigma 公司；Annexin VFITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 和人正常肺上皮細(xì)胞HBE 中miR-29c、NASP mRNA 的檢測 采用RT-qPCR 法。取對數(shù)生長期的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 和人正常肺上皮細(xì)胞HBE，用TRIzol 裂解細(xì)胞提取RNA 后，按逆轉(zhuǎn)錄盒說明書操作合成cDNA，最后按照RT-qPCR 試劑盒說明書操作檢測miR-29c 和NASP mRNA，用2-ΔΔCt表 示miR-29c 和NASP mRNA 的相對表達(dá)量。miR-29c 的上游引物為5"-GGGTAGCACCATCTGAAAT-3"；下游引物為5"-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3"；NASP 的上游引物為5"-TCCAGTCCTGCCTTAACCTG-3"，下游引物為5"-GCCACTGCCTCATCATACTG-3"。GAPDH 的 上游引物為5"-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3"，下游引 物 為5"-AGATCCACAACGGATACATT-3"；U6 的上游引物為5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游引物為5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。

1.3 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和人正常肺上皮細(xì)胞HBE 中NASP 蛋白的檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)生長期的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 和人正常肺上皮細(xì)胞HBE，RIPA 裂解后提取總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量后變性，蛋白上樣進(jìn)行SDSPAGE 分離，之后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。次日洗膜后再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37 ℃孵育2 h。 結(jié)束后加入ECL 發(fā)光液顯影曝光。 以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

1.4 A549細(xì)胞的分組及miR-29c、NASP的轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞，將細(xì)胞分為miR-29c 組（轉(zhuǎn)染miR-29c 過表達(dá)序列）、miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-29c 陰性對照序列）、si-NASP 組（轉(zhuǎn)染NASP 沉默序列）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染NASP沉默陰性對照序列）、miR-29c+si-NASP 組（miR-29c 過表達(dá)和NASP 過表達(dá)陰性對照序列共轉(zhuǎn)染）和miR-29c+NASP 組（miR-29c過表達(dá)和NASP 過表達(dá)序列共轉(zhuǎn)染），轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染12 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染48、60、72 h 時分別收集細(xì)胞上清病毒溶液。將收集所得病毒溶液合并，將病毒上清與PEG8000 以15∶4 的比例進(jìn)行混合，4 ℃靜置過夜。4 000 g 離心20 min，棄上清，病毒沉淀用RPMI1640 培養(yǎng)基重懸。隨后將病毒加入到對數(shù)生長期的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 中，感染48 h 后，用1 μg/mL 的嘌呤霉素篩選未感染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，待細(xì)胞全部表達(dá)綠色熒光時表明慢病毒穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。

1.5 轉(zhuǎn)染miR-29c、NASP 的A549 細(xì)胞生物學(xué)行為觀察

1.5.1 各組A549 細(xì)胞增殖活性、凋亡率的測算取適量對數(shù)生長期的各組A549 細(xì)胞，按5×104個/孔，接種于96 孔板中，加入10 μL CCK8 試劑，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h，分別在24、48、72、96 h 用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處測定吸光度（OD）值，每組重復(fù)測定3次取平均值，以O(shè)D值表示相對細(xì)胞增殖活性。

取適量對數(shù)生長期的各組A549 細(xì)胞，按1×106個/孔，接種于6 孔板中，隨后用胰蛋白酶消化離心并收集細(xì)胞，PBS 洗3 次，加入500 μL 結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，取100 μL 緩沖液至流式管內(nèi)，分別加入5 μL Annexin V-APC 和10 μL 7-AAD 試劑，混勻后于室溫避光孵育5 min，加入結(jié)合液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.5.2 各組A549 細(xì)胞的遷移、侵襲個數(shù)測算 采用Transwell 法。取適量對數(shù)生長期的各組A549 細(xì)胞，取2×104個細(xì)胞加入上室，加600 μL 含血清的培養(yǎng)基加入下室，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS 洗滌3 次，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，再用PBS 洗滌數(shù)次。顯微鏡下隨機(jī)選取5 個視野拍照計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)操作步驟按照細(xì)胞遷移檢測試驗(yàn)，在小室上表面涂抹適當(dāng)厚度的基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠干后，后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下隨機(jī)選取5 個視野拍照計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

1.6 miR-29c 與NASP 靶向關(guān)系預(yù)測、驗(yàn)證 用生物信息學(xué)軟件TargetScan 預(yù)測到miR-29c 與NASP的3’-UTR 端有結(jié)合位點(diǎn)，將NASP 的3’-UTR 端互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)突變，構(gòu)建MUT 熒光素報告載體，同時構(gòu)建野生型WT 熒光素報告載體采用Lipo?fectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑輔助共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)分組為NC mimics + h-NASP-wt 組、hsa-mir-29c-3p + h-NASP-wt 組、NC mimics + h-NASP-mu組、hsa-mir-29c-3p + h-NASP-mu 組。根據(jù)Dual-Lu?ciferase?報告基因試劑盒說明書檢測各組熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 與正常肺上皮細(xì)胞HBE 中miR-29c mRNA、NASP mRNA 及NASP 蛋白表達(dá)比較 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 中miR-29c mRNA、NASP mRNA 及NASP 蛋白相對表達(dá)量分別為0.56±0.07、3.95±0.13、2.89±0.12，肺上皮細(xì)胞HBE 中miR-29c mRNA、NASP mRNA 及NASP 蛋白相對表達(dá)量分別為0.95 ± 0.05、1.06 ± 0.04、0.12 ± 0.03，與肺上皮細(xì)胞HBE 比較，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 中miR-29c mRNA 的表達(dá)下降，NASP mRNA 和蛋白表達(dá)升高（P 均<0.05）。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 中，miR-29c 組、miR-NC 組NASP 蛋白表達(dá)分別為0.15±0.02、1.15±0.11，兩組比較，P<0.05；miR-29c+NASP 組、miR-29c+NC 組NASP 蛋白表達(dá)分別為0.90±0.25、0.29±0.04，兩組比較，P<0.05。

2.2 不同時間各組A549細(xì)胞增殖活性比較 培養(yǎng)24、48、72、96 h，miR-29c 組細(xì)胞OD 值分別為0.24±0.06、0.34±0.05、0.44±0.05、0.54±0.05，miRNC 組 分 別 為0.24 ± 0.05、0.40 ± 0.05、0.83 ±0.06、1.24±0.06，與miR-NC 組相比，培養(yǎng)72 h、96 h 時miR-29c 組細(xì)胞的OD 值升高（P 均<0.05）。培養(yǎng)24、48、72、96 h，si-NASP 組細(xì)胞OD 值分別為0.25 ± 0.02、0.35 ± 0.04、0.44 ± 0.03、0.66 ±0.05，si-NC 組 分 別 為0.26 ± 0.02、0.44 ± 0.03、0.86 ± 0.07、1.21 ± 0.10，與si-NC 組相比，培養(yǎng)48、72、96 h 時si-NASP 組 細(xì)胞的OD 值降低（P 均<0.05）。培養(yǎng)24、48、72、96 h ，miR-29c+NASP 組細(xì)胞OD 值分別為0.12 ± 0.03、0.20 ± 0.01、0.41 ±0.03、0.65 ± 0.04，miR-29c+NC 組 分 別 為0.12 ±0.01、0.18 ± 0.08、0.28 ± 0.05、0.52 ± 0.06。與miR-29c+NC 相比，培養(yǎng)72 h、96 h 時miR-29c+NASP組細(xì)胞的OD值升高（P均<0.05）。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 miR-29c、miR-NC 組細(xì)胞凋亡率分別為5.44% ± 1.12%、1.42% ± 0.07%，兩組比較，P 均<0.05。si-NASP 組、si-NC 組細(xì)胞凋亡率分別為4.07% ± 0.31%、2.25% ± 0.14%，兩組比較，P 均<0.05。miR-29c+ NASP、miR-29c+ NC 組細(xì) 胞 凋 亡 率 分 別 為4.03% ± 0.35%、7.89% ±0.41%，兩組比較，P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞遷移個數(shù)、侵襲個數(shù)比較 miR-29c+NASP 細(xì)胞遷移個數(shù)、侵襲個數(shù)分別為（183.67 ±5.51）、（182.33 ± 5.86）個，miR-29c+NC 組分別為（92.33±4.93）、（86.00±7.00）個，兩組比較，P均<0.05。si-NASP 組細(xì)胞遷移個數(shù)、侵襲個數(shù)分別為（99.33 ± 6.03）、（110.33 ± 8.96）個，si-NC 組分別為（204.33±4.93）、（190.67±8.02）個，與si-NC 組相比，si-NASP 組細(xì)胞遷移及侵襲個數(shù)減少（P 均<0.05）。miR-29c 組細(xì)胞遷移個數(shù)、侵襲個數(shù)分別為（94.67±4.51）、（96.33±6.43）個，miR-NC 組分別為（206.00±6.56）、（196.00±5.29）個，兩組比較，P均<0.05。

2.5 NASP、miR-29c 靶向關(guān)系預(yù)測及驗(yàn)證結(jié)果miR-29c 與NASP 存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。NC mim?ics+h-NASP-wt 組、hsa-mir-29c-3p+h-NASP-wt 組、NC mimics+h-NASP-mu 組、hsa-mir-29c-3p+h-NASP-mu組熒光素酶活性值為1.00 ± 0.03、0.61 ± 0.02、1.00 ± 0.04、1.00 ± 0.01。與NC mimics+h-NASPwt 組相比，hsa-mir-29c-3p+h-NASP-wt 組細(xì)胞的熒光素酶活性值降低（P<0.01）；NC mimics+h-NASP-mu組與hsa-mir-29c-3p+h-NASP-mu 組細(xì)胞的熒光素酶活性值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示NASP 是miR-29c的靶基因。

圖1 hsa-miR-29c-3p與h-NASP-3UTR靶位點(diǎn)結(jié)合示意圖

3 討論

肺癌是威脅人類生命健康的一種惡性腫瘤。肺癌的主要病理類型包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩大類，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%～85%。雖然近年來主要通過外科手術(shù)聯(lián)合放療、化療及基因治療等綜合治療方案，明顯提高了肺癌患者的總體生存率，但存在食管癌、脊髓炎等嚴(yán)重的并發(fā)癥，治療效果仍不令人滿意，預(yù)后較差，非小細(xì)胞肺癌患者的5 年生存率仍然不容樂觀，在發(fā)展中國家仍未超過9%，在發(fā)達(dá)國家仍不足16%，其中伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者5 年生存率僅為2%。因此，尋找一種新型的治療手段尤為重要。

miRNAs為18～22 nt的非編碼小RNA，可與下游靶基因mRNA 的3"-UTR 結(jié)合，促進(jìn)其降解或者抑制其翻譯，發(fā)揮基因調(diào)控功能。大量研究表明，miRNA 是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，通過調(diào)控靶基因，廣泛調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、代謝等功能，從而參與各種病理生理過程，與許多疾病的發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤中，表達(dá)異常的miRNAs 通過靶向癌基因或抑癌基因，發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用，參與癌變進(jìn)程的每個階段。近年大量研究表明，miRNA 與乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌等多種癌癥密切相關(guān)［1-3］，其中，miR-29c作為miR-29家族的一員，在癌癥中異常表達(dá)，影響癌癥患者的預(yù)后［4-6］。ZHAN 等［7］運(yùn)用RT-PCR 法檢測正常肺組織和NSCLC 組織發(fā)現(xiàn)，miR-29c 在NSCLC 中低表達(dá)。LIU 等［8］在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-29c 在NSCLC 組織中的低表達(dá)與患者的預(yù)后不良有關(guān)。已有研究證實(shí)，過表達(dá)miR-29c 后可降低肺腺癌A549細(xì)胞的遷移、侵襲能力，升高其凋亡率，抑制其細(xì)胞活力［7］，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。XU 等［5］發(fā)現(xiàn)，miR-29c 在鼻咽癌細(xì)胞中低表達(dá)，并且過表達(dá)miR-29c 后，鼻咽癌細(xì)胞的活力和遷移、侵襲能力下降。miR-29c 也可通過調(diào)控靶基因，發(fā)揮抑癌作用［8］，可通過靶向VEGF 基因，抑制肺癌的進(jìn)展；在其他癌癥中，miR-29c 也可通過調(diào)控致癌基因CDK6、CDC42 發(fā)揮作用［9-10］。非小細(xì)胞肺癌的生長增殖亦受癌基因的調(diào)控，孫艷婷等［11］提出沉默PGRN 基因能明顯抑制A549 細(xì)胞的增殖。李蘇霞等［12］發(fā)現(xiàn)，沉默PDK1 基因可發(fā)揮抑制A549 細(xì)胞生長的作用。本研究結(jié)果顯示，與正常肺上皮細(xì)胞HBE 對 比，miR-29c mRNA 在A549 細(xì) 胞 中 表達(dá) 下降。在A549 細(xì) 胞 中 過 表 達(dá)miR-29c 后，CCK8 及Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A549 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力下降，流式實(shí)驗(yàn)顯示凋亡率升高，提示miR-29c在肺癌A549 細(xì)胞中低表達(dá)，miR-29c 可抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力，促進(jìn)其凋亡，在肺癌A549細(xì)胞中miR-29c起到抑癌基因的作用。

NASP 是一種組蛋白伴侶，存在于所有的分裂細(xì)胞中，并同時結(jié)合核心和連接蛋白［13］。已有研究發(fā)現(xiàn)，NASP 與腫瘤細(xì)胞的生長增殖密切相關(guān)［14-15］。有研究提出，NASP 在腎癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲低tNASP 基因可有效抑制腎癌細(xì)胞增殖，并通過REK/MAPK 信號通路引起G1 期阻滯。YU 等［15］證實(shí)，在胃癌組織中沉默NASP 基因后，可抑制胃癌細(xì)胞增殖，升高凋亡率。另有研究提出，沉默tNASP可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡［16］。本研究中，與正常肺上皮細(xì)胞HBE 相比，A549 細(xì)胞中NASP mRNA和蛋白表達(dá)均升高；在A549 細(xì)胞沉默靶基因NASP后，肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力下降，凋亡率升高；過表達(dá)NASP后，A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力升高，凋亡率下降。與文獻(xiàn)報道一致，說明NASP為肺癌的促癌基因。

本研究中，在A549 細(xì)胞中過表達(dá)miR-29c 后，NASP 蛋白表達(dá)水平下降。過表達(dá)NASP 可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-29c 對A549 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用和對其凋亡的促進(jìn)作用。猜測NASP 和miR-29c 存在靶向作用關(guān)系。我們通過TargetScan 軟件分析發(fā)現(xiàn)，NASP 是miR-29c 的潛在靶標(biāo)，并且雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NASP 和miR-29c 的靶向關(guān)系。說明miR-29c 可能通過靶向抑制NASP 的表達(dá)從而抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 中miR-29c表達(dá)降低、NASP 表達(dá)升高。 miR-29c 可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲，并促進(jìn)其凋亡，而NASP促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移侵襲，并抑制其凋亡，并且過表達(dá)NASP 可逆轉(zhuǎn)miR-29c 對A549 細(xì)胞增殖和遷移、侵襲能力的抑制作用和對其凋亡的誘導(dǎo)作用。miR-29c 與NASP 存在靶向關(guān)系。但是，關(guān)于miR-29c 影響肺腺癌A549 細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不完全清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。