趨化因子配體13在肝細胞癌組織中的表達及與臨床病理特征和預后關系

何海濤，王智翔，張小弟，沈乃營，張 毅

(1.西安醫學院,陜西 西安710068；2.西安醫學院附屬陜西省核工業二一五醫院普外科,陜西 咸陽 712000)

原發性肝癌在我國原發性腫瘤致死病因中占第2位，其中肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma， HCC)是其主要病理類型，約占85%～90%[1],HCC的發生與病毒性肝炎感染密切相關[2]。由于HCC發病早期常無明顯癥狀，導致容易出現診斷和治療的延誤，加之肝癌切除術后復發、轉移率高，導致HCC患者遠期生存率較差。目前有研究證實，HCC的發病機制與腫瘤的微環境以及某些信號通路的異常激活等多種因素相關，其中包括炎癥相互作用中的趨化因子和趨化因子受體[3]，而趨化因子配體及其受體之間相互作用可招募不同的免疫細胞亞群至腫瘤微環境中(Tumor microenvironment,TME)，從而促進腫瘤細胞增殖、血管新生，調控宿主對腫瘤的免疫應答、侵襲性及其新陳代謝產物，最終對腫瘤進展和預后均產生顯著影響[4-5]。趨化因子配體13(Chemokine ligand 13,CXCL13)屬CXC趨化因子亞族，其與其特異性受體CXC趨化因子亞族趨受體5(C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5)結合，與多種惡性腫瘤(如胃癌、結直腸癌、腎癌、前列腺癌等)的發生、發展和轉移密切相關[6-9]。本文利用免疫組織化學方法檢測肝細胞癌組織和相應癌旁組織中CXCL13的表達情況，旨在明確其陽性表達與肝細胞癌患者臨床病理特征、預后及術后復發的相關性，為HCC的診斷和治療提供新依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 組織標本收集普外科2012年6月至2014年6月行肝癌切除術且經病理證實的肝細胞癌組織標本及相應癌旁組織111例 ，所有患者術前均未接受任何形式的治療。111例HCC患者中，男 96例，女15例，年齡26～74歲，平均(50.31±10.92)歲。根據肝癌病理Edmondson-Steiner 四級分級法：Ⅰ、Ⅱ級64例，Ⅲ、Ⅳ級47例。根據美國癌癥聯合委員會惡性腫瘤分期(TNM)：Ⅰ、Ⅱ期41例 ，Ⅲ、Ⅳ期70例。術后隨訪采用電話、門診復查及住院治療方式，以手術日期為開始時間，截止時間為2019年6月30日，所有隨訪患者中位總生存時間為23月，死亡67例，失訪18例。

1.2 主要試劑 即用型免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福建邁新生物科技公司；兔抗人CXCL13多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.3 免疫組化學檢測肝癌組織和癌旁組織CXCL13表達 取病理科保存的術后石蠟包埋組織切片標本，采用Elivison兩步免疫組化法檢測HCC組織及相應的癌旁組織中的CXCL13表達。所有操作步驟均嚴格按照試劑盒說明進行。結果判定：免疫組化染色結果由4名病理科醫師采用雙盲原則評定。每張切片選取5個高倍鏡視野進行觀察。其中染色強度評分：0分為無染色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。陽性細胞占比：0 分，<5% ；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分， 50%～75%；4分，>75%。染色強度和陽性細胞占比計分之和為該病例評分值，≤2分為陰性；≥3分為陽性。

1.4 統計學方法 所有數據使用SPSS 25.0統計學軟件進行統計學分析，計數資料以百分比表示，采用卡方檢驗比較CXCL13在HCC組織和相應癌旁組織中的表達情況，評估HCC組織中CXCL13表達與各臨床病理數據之間的關系。生存分析采用 Kaplan-Meier生存曲線，單因素分析用 Log-Rank檢驗，多因素分析用 Cox回歸模型，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CXCL13在HCC組織及癌旁組織中表達情況 免疫組化結果顯示CXCL13在HCC癌組織和癌旁組織的胞漿中均有表達(圖1)，其中癌組織中陽性表達為62.16%(69/111)，相應癌旁組織中陽性表達為30.63%(34/111)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 CXCL13在癌組織及相應癌旁組織中的表達情況(例)

注：A、B分別為癌組織和癌旁組織陽性表達，C為正常肝組織(陰性)

2.2 HCC患者CXCL13表達與臨床病理特征的關系 見表2。CXCL13在有血管浸潤組織中的陽性表達率明顯高于無血管浸潤組織，在TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期的陽性表達率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期的陽性表達率(均P<0.05)；癌組織中的CXCL13陽性表達在HCC患者的不同年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)值、腫瘤最大直徑、分化程度中差異均無統計學意義(均P>0.05)。

表2 HCC患者CXCL13表達與臨床病理特征的關系(例)

2.3 HCC組織CXCL13表達與肝癌預后的關系 見表3。結合肝癌患者臨床病例資料，采用單因素分析結果顯示：甲胎蛋白、血管浸潤、TNM分期、癌組織CXCL13表達是肝細胞癌的預后相關因素(均P<0.05)；多因素回歸分析表明：甲胎蛋白、癌組織CXCL13表達是肝癌患者獨立預后相關因素。年齡、性別、有無HBV感染、有無肝硬化、腫瘤最大直徑、分化程度、腫瘤數目對患者預后無影響(均P>0.05)。

表3 HCC患者預后單因素與多因素COX回歸模型分析

2.4 HCC組織CXCL13表達情況與患者術后無復發生存率和預后的關系 Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示：HCC組織中CXCL13表達陰性患者1、3、5年累積生存率分別為86.1%、62.0%、49.1%，總生存時間為(36.95±2.59)月，而CXCL13表達陽性患者1、3、5年累積生存率分別為62.5%、12.8%、0，總生存時間為(23.00±3.23)月；CXCL13表達陰性患者1、3、5年無復發生存率分別為91.1%、67.1%、44.9%，總生存時間為(30.98±3.01)月，而CXCL13表達陽性患者1、3、5年無復發生存率分別為62.5%、11.4%、0，總生存時間為(15.52±3.33)月。CXCL13陰性表達組總生存時間和無復發生存時間優于陽性表達組(P=0.0023、0.0085)(圖2)。

圖2 CXCL13表達與HCC患者術后無復發生存率和預后的關系

3 討 論

肝細胞癌是我國常見惡性腫瘤之一，目前主要借助檢測血清AFP等指標結合影像學檢查對高危人群進行篩查。確診患者以外科治療為主，同時腫瘤局部消融、經導管動脈化療栓塞術、放射治療、全身化療等多種手段也取得了較好的療效。但HCC發病機制復雜，具有術后易復發、易轉移的特性，且臨床中部分患者肝硬化進展到較為嚴重階段，限制了治療手段實施，HCC總體治療效果并不十分理想[10]。近年來趨化因子及其受體與肝癌關系的研究廣受關注。

趨化因子配體通過與其G蛋白耦聯受體(G-protein coupled receptor，GPCR) 相結合形成趨化因子配體/受體軸，從而影響下游的信號分子，在炎癥、感染、免疫反應以及腫瘤微環境中起重要的調控作用[11]。CXCL13是CXC趨化因子家族成員之一，主要分布在肝臟、脾臟、淋巴結、闌尾、胃以及乳腺等處。一般認為CXCR5是CXCL13的唯一受體，CXCL13與其受體CXCR5結合形成CXCL13/CXCR5軸，許多實體腫瘤可利用CXCL13/CXCR5信號作為中心軸，整合多種細胞內信號事件和細胞間的相互作用，從而獲得侵襲生長和轉移能力。腫瘤基質細胞分泌的CXCL13誘導上皮腫瘤細胞表達CXCR5可趨化CXCR5+的上皮腫瘤細胞實現腫瘤上皮-間質轉換，同時CXCR5上調的腫瘤細胞可向局部淋巴結趨化，實現腫瘤的淋巴結轉移[12-13]。Chunyan等[14]研究發現，肝癌患者組織中和血清中CXCL13水平增高，可誘導分泌細胞因子IL-12和IL-17及Ig G4而影響腫瘤的微環境，并與Wnt/β-catenin信號通路正反饋相互調控表達而促進HCC的進展。Duan等[15]在HBV相關性肝細胞癌研究發現HCC患者血清CXCL13水平升高，且免疫組化染色顯示CXCL13/CXCR5在低分化腫瘤中百分率高于高分化腫瘤，CXCL13升高與無復發生存率有關，與總生存率無關。曾灝等[16]在HCC患者病例對照研究中發現，HCC患者血清CXCL13水平明顯高于健康對照組，而CXCL13表達水平與HBV無關；HCC患者血清IL-31水平和健康對照組中無差異；此外還有研究表明，聯合檢測血清CXCL13與AFP可提高HCC診斷的敏感度。同時也有研究表明CXCL13水平增高會增加腫瘤對化療藥物的耐藥性，從而為我們制定個性化治療方案提供了思路[17]。值得一提的是，關于CXCL13在乳腺腫瘤和大腸腫瘤表達水平增高研究模型中有不同的研究結果。 Alcaraz-Sanabria等[18]研究發現CXCL13的表達水平與Basal-like型乳腺癌浸潤免疫細胞(樹突狀細胞和CD8+T細胞)的表達呈正相關，而這些細胞參與了抗腫瘤免疫效應的激活。Evangelia等[19]在早期乳腺癌研究中發現CXCL13在Luminal-HER2陽性乳腺癌患者中高表達可明顯改善預后，考慮與CXCL13作為B淋巴細胞趨化因子在介導宿主對腫瘤的免疫反應中起作用有關。Xing等[20]在結直腸癌研究中發現CXCR5+CD8+T細胞亞群可能具有潛在的抗腫瘤活性；有文獻報道，結直腸癌的腫瘤微環境中B細胞和濾泡輔助性T細胞數量隨腫瘤分期增加而增加，數量越多預后越好；而CXCL13缺失或低表達患者TME中B細胞、濾泡輔助性T細胞、Th1細胞和細胞毒性T淋巴細胞密度較低，預后較差[21]。這些不同的研究結果可能與腫瘤的分化和分期、治療情況、基因等因素相關。

本研究發現，HCC組織中CXCL13的陽性表達與血管浸潤和TNM分期相關，主要是由于有研究發現，隨著肝癌進展，CXCL13在肝癌組織中的mRNA水平及患者外周血中的表達水平明顯增加，即隨著肝癌臨床分期的進展，會出現腫瘤體積增大及血管侵襲，甚至出現淋巴結的遠處轉移，從而導致CXCL13水平增加，增加了其陽性表達[16]；甲胎蛋白、血管浸潤、TNM分期、癌組織CXCL13表達是肝細胞癌的預后相關因素，表明隨著肝癌病情進展，甲胎蛋白、血管浸潤水平、TNM分期、CXCL13水平會不斷增加，其會顯著影響肝癌患者預后；多因素回歸分析表明癌組織CXCL13表是肝細胞癌患者獨立預后因素。Kaplan-Meier生存曲線分析結果表明， CXCL13陽性表達組總生存時間和無復發生存時間比陰性表達組短，CXCL13陽性表達提示預后不良，可能是由于CXCL13與患者的ALT、AST水平呈正相關，而以上指標是衡量肝功能的重要指標，其可提示患者肝臟的損傷程度，因此若患者的CXCL13水平的增加，患者的肝臟損傷程度越大，導致預后較差[22]；同時有研究發現，CXCL13在體外模擬HCC細胞環境下，其可抑制IL-12分泌，促進IL-17的分泌，而IL-12可誘導天然T細胞或NK細胞產生γ干擾素，促進Th細胞的分化，從而增強細胞免疫，激活細胞毒性T細胞，產生抑制血管形成作用，具有抗腫瘤作用；IL-17可促進細胞毒性T細胞免疫應答來抑制腫瘤生長，同時其可通過促進血管生成及腫瘤細胞遷移來促進腫瘤生長，因此隨著CXCL13水平增加，會促進腫瘤生長，不利于患者治療預后[19]。

綜上，趨化因子CXCL13在肝細胞癌組織中陽性表達與HCC的術后復發和預后密切相關。因此我們可以推斷CXCL13可能是監測HCC發展和預后的潛在標志物之一，可能為肝細胞癌患者的診斷和治療提供新的靶點。