類風濕關節炎患者血清IL-13水平表達及對外周血單個核細胞中Th17細胞亞群分化的影響

李長超，柴艷梅，劉 丹，周 成，陳 蓉，黃文峰

(1.荊門市第二人民醫院，湖北 荊門 448000；2.西安市第五醫院，陜西 西安710082 )

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關節滑膜炎癥為主的一種慢性自身免疫性疾病，在世界范圍內的發病率約為1%[1]。研究表明免疫細胞、細胞因子參與RA的發病過程，其中輔助性T 細胞17(T helper cell 17，Th17)在RA發病中起重要作用[2-3]。研究[4]發現，Th2細胞具有抑制Th17的作用，激活后的CD4+Th2細胞可生成白細胞介素-13(Interleukin-13，IL-13),不僅具有免疫刺激功能,上調CD28配體和CD80的表達，還有重要的抗炎功能,下調腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、IL-6及IL-1β等促炎細胞因子的生成。目前關于IL-13在RA發病中的具體作用和相關分子機制仍不明確，本研究通過分析IL-13與RA患者病情的相關性，觀察IL-13對Th17細胞亞群分化的影響，探討其在RA免疫調控中的可能機制，為IL-13相關生物制劑的臨床應用提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至2019年6月就診的RA患者60例，根據RA 28個疾病活動性評分(DAS28)分為活動組(DAS28評分≥2.8，n=30)和穩定組(DAS28評分<2.8，n=30)。另選體檢中心健康志愿者30例作為正常組。RA診斷符合2010 年 ACR 與歐洲風濕病學會(EULAR)聯合修訂的 RA 分類標準。排除標準：有嚴重心肺功能異常；骨髓造血障礙疾病、胃十二指腸潰瘍活動期；正處于妊娠期或哺乳期婦女；過敏體質及患有精神疾病等患者。活動組男11例，女19例，平均年齡為(45.0±10.3)歲；穩定組男10例，女20例，平均年齡為(43.7±10.6)歲；正常組男10例，女20例，平均年齡為(44.6±10.9)歲。三組在年齡、性別方面比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。

1.2 儀器與試劑 人IL-13 ELISA試劑盒、人IL-17A ELISA試劑盒、淋巴細胞分離液(愛必信生物科技有限公司)，RPMI-1640培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)，重組人白細胞介素13(rhIL-13)(美國R&D公司)，抗人CD3和抗人CD28(美國BioLegend公司)，Easy Sep人CD4+T 細胞磁珠分選盒(加拿大STEMCELL Technologies公司)，磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS) 、Trizol試劑[寶生物工程(大連)有限公司]。使用的儀器包括全自動定量酶標儀、臺式離心機、全自動熒光定量PCR擴增儀。

1.3 研究方法

1.3.1 血清IL-13檢測：所有研究對象取晨起空腹全血3 ml,3000 r/min離心10 min分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測RA患者及正常組血清IL-13表達水平，并將RA患者與疾病活動度評分、紅細胞沉降率(ESR)及C反應蛋白(CRP)進行相關性分析。ESR采用魏氏法檢測，CRP為免疫比濁法檢測。

1.3.2 人CD4+T細胞體外磁珠分選：RA活動期患者4例和正常組4例，取肝素抗凝外周血約20 ml，按常規方法[3]分離人外周血單個核細胞(PBMC)。使用Easy Sep人CD4+T細胞分離試劑盒，從上述獲得的PBMC中純化CD4+T的細胞。分離過程嚴格按照說明書進行。

1.3.3 IL-13分組干預：分為IL-13干預組和對照組。IL-13干預組：在純化RA患者的CD4+T細胞培養基中加入rhIL-13(100 ng/ml)，用抗CD3(5 μg/ml)和抗CD28(2 μg/ml)進行目標細胞刺激。對照組：純化健康體檢者CD4+T細胞培養基中加入等量的PBS。48 h后收集上清液，通過ELISA檢測上清中IL-17A表達水平；Trizol法提取細胞RNA并反轉cDNA,RT-PCR法檢測IL-17A mRNA的表達水平。引物序列：人IL-17A上游引物，5’-AGATTACTACAACCGATCCACCT-3’；人IL-17A下游引物，5’-GGGGACAGAGTTCATGTGGTA-3’；人β-actin上游引物，5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3’；人β-actin下游引物，5’-GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3’。

2 結 果

2.1 三組血清IL-13表達水平比較 活動組血清IL-13表達水平為(166.4±21.4)pg/ml，穩定組和正常組分別為(123.4±12.3)pg/ml和(86.2±11.0)pg/ml。RA患者血清IL-13水平高于正常組，差異具有統計學意義(P=0.0002)，且RA活動組IL-13水平明顯高于穩定組，差異具有統計學意義(P=0.0008)。

2.2 血清IL-13與RA疾病活動指標相關性分析 RA患者血清IL-13與DAS28評分具有正相關性(r=0.583，P<0.001)；IL-13與ESR具有正相關性(r=0.217，P<0.001)；IL-13與CRP具有正相關性(r=0.477，P<0.001)。見圖1。

圖1 RA患者血清IL-13與DAS28、ESR和CRP的相關性

2.3 IL-13對Th17細胞分化的影響 收集上清液應用ELISA法檢測IL-17A水平，RA組IL-17A水平顯著高于對照組；IL-13干預后，RA患者CD4+T細胞IL-17A水平顯著降低。這些結果提示RA患者外周血CD4+T細胞中Th17細胞比例更高，且IL-13能夠顯著抑制CD4+T細胞向Th17方向分化。見圖2。

注：與RA組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.4 RT-PCR法檢測各干預組CD4+T細胞IL-17A mRNA表達水平 結果顯示，與RA組相比，加入rhIL-13后RA患者的IL-17A mRNA表達量減少，差異具有統計學意義(P=0.01)，對照組與對應的加入rhIL-13干預組比較兩組細胞中IL-17A mRNA表達水平比較無統計學差異(P=0.39)。見圖3。

注：與RA組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

RA是一種慢性、進行性、侵蝕性疾病，其病理組織可見淋巴細胞活化增殖和炎癥細胞因子大量釋放，導致滑膜增殖、軟骨及骨組織侵襲破壞等病理損害[5]。研究顯示，Th1，Th2和Th17細胞的比例失衡與RA的發生發展密切相關，可直接參與RA的發病，促進炎癥進展[3,6-7]。目前研究發現，細胞因子水平和與RA發病機制密切相關，對明確開發靶向治療RA藥物有指導意義[8-9]。IL-13主要由活化的Th2細胞生成，對單核巨噬細胞、B細胞及嗜酸性粒細胞等均有較強的生物學活性。Yanpin等[10]發現IL-13可減低小鼠膠原關節炎的發生率及嚴重程度，減輕關節的損傷。IL-13作為一種具有抗炎作用的細胞因子，可能在RA的發生發展中發揮抑制病情進展的作用。IL-13同時也具有重要的免疫調節活性，不僅在變應性疾病、寄生蟲感染性疾病中發揮作用，也在自身免疫系統疾病起到重要作用。另外，IL-13發揮較強的抗炎活性，能夠加強IL-1R拮抗劑的產生，對抗IL-1致炎作用，還能有效下調IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子生成，調節各種炎癥的中間產物[11]。T細胞免疫調控是RA主要的免疫應答，CD4+T分為Th1，Th2，Th17和Treg細胞亞群，其中Th17細胞直接參與RA的發病，促進炎癥進展中起主導作用[12-14]。

本研究發現IL-13在RA患者中表達水平升高，并與DAS-28、ESR和CRP呈正相關，說明IL-13參與了RA的發病機制，并且RA病情的嚴重程度與IL-13水平升高呈正相關，IL-13水平高低一定程度反應RA患病狀態。前期也有報道，IL-25誘導CD4+T細胞活化和分化中的潛在作用，發現IL-25顯著抑制RA患者 CD4+T細胞活化以產生促炎細胞因子IL-17A并促進IL-4分泌，同時發現，IL-25明顯抑制了RA患者 CD4+T細胞向Th17細胞的分化。在RA中，IL-25抑制CD4+T細胞活化和分化為Th17細胞，而不會影響Th1細胞，重要的是IL-13對于IL-25介導的膠原誘導的類風濕小鼠模型(CIA)發病進程的抑制是必需的。其中，RA或CIA CD4+細胞阻斷IL-13的分泌，CD4+T細胞顯著減弱了IL-25在Th17免疫應答中的抑制作用[15]。我們的研究旨在發現IL-13誘導CD4+T細胞活化和分化中的潛在作用，發現IL-13活化RA患者 CD4+T細胞以產生促炎細胞因子IL-17A。

我們分離純化健康成人對照組和RA患者外周血CD4+T細胞，然后用IL-13進行干預，結果顯示，RA組IL-17A水平顯著高于對照組，提示RA患者外周血CD4+T細胞中Th17細胞比例更高，且IL-13能夠顯著抑制CD4+T細胞向Th17方向分化。通過RT-PCR方法檢測IL-13干預后各組CD4+T細胞IL-17A mRNA表達水平，再次驗證了IL-13能夠顯著抑制RA患者外周CD4+T細胞IL-17A的表達，即抑制向Th17方向分化。

綜上所述，本研究發現IL-13參與RA免疫反應，并具有抑制Th17分化作用，對IL-13的檢測有助于了解RA患者的免疫狀態，為疾病進展及免疫治療提供一定臨床依據。隨著對IL-13不斷深入研究，IL-13可能成為優化RA治療方案的新靶點。