3-甲基腺嘌呤腹腔注射干預(yù)大鼠胃竇組織自噬最佳藥物劑量與用藥時(shí)間探討

肖小娟,魏 星,趙莎彤,陳 巧,陳絲怡,彭 艷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

細(xì)胞自噬是進(jìn)化上高度保守的降解細(xì)胞內(nèi)異常蛋白和受損細(xì)胞器以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和自我更新的過程，自噬也是真核細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)、實(shí)現(xiàn)更新的一種重要進(jìn)化機(jī)制[1-2]。細(xì)胞自噬是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，它與腫瘤[3]、心臟疾病[4]、肝臟疾病[5]、糖尿病[6]等多種常見疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)是常用的自噬抑制劑，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7-11]后發(fā)現(xiàn)3-MA多用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，較少用于在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，然而有些研究其處理因素必須作用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而非細(xì)胞，這種情況下需要用3-MA進(jìn)行在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但不同實(shí)驗(yàn)所使用的藥物劑量各有不同[12-15]。本研究選用了三組常用劑量10、15、30 mg/kg的3-MA給雄性SD大鼠腹腔注射進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以探索3-MA作用于大鼠影響其自噬的最佳藥物劑量。另外不同的處理因素干預(yù)時(shí)長也有所不同，有些干預(yù)時(shí)間較長，在10 d以上[16]，所以本研究選擇15 d作為干預(yù)時(shí)間，觀察3個(gè)不同劑量的作用效果，并選用3個(gè)劑量中的最大劑量30 mg/kg干預(yù)1、3、15 d以摸索3-MA用于大鼠對(duì)自噬抑制的維持時(shí)間有多長，為后期進(jìn)行自噬相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 21只健康雄性SD大鼠，SPF 級(jí)，體重為180～220 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，動(dòng)物購買后均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，室溫 19～26 ℃，相對(duì)濕度 40%～70%，晝夜循環(huán)，保持12 h光照。將大鼠編號(hào)1～21，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。將21只健康雄性 SD大鼠隨機(jī)分為以下七組：A組3-MA 10 mg/kg組、B組3-MA 15 mg/kg組、C組3-MA 30 mg/kg組、D組PBS組、E組空白對(duì)照組、F組3-MA 30 mg/kg 3 d組、G組3-MA 30 mg/kg 1 d組，每組3只。

1.2 主要試劑與儀器 3-MA(貨號(hào)M129496，阿拉丁)、雷帕霉素(Rapamycin，RAPA,貨號(hào)R817296，麥克林)、PBS緩沖液(貨號(hào)PB180327，普諾賽)、二甲基亞砜(DMSO，貨號(hào)D806645,麥克林)、兔多抗GAPDH(37 kD，貨號(hào)AB-P-R 001，杭州賢至生物有限公司)、兔多抗LC3B(19 kD，貨號(hào)ab48394，Abcam)、兔多抗P62(62 kD，貨號(hào)E-AB-62289)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(貨號(hào)BA1054，武漢博士德生物工程有限公司)、電泳儀電源(型號(hào)DYY-7C，北京六一儀器廠)、垂直電泳槽(型號(hào)DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)、電轉(zhuǎn)儀(型號(hào)DYCZ-40，北京六一儀器廠)、水平搖床(型號(hào)TS-1，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)、pH計(jì)(型號(hào)LP115，德國Metter-Toledo GmbH公司)、電子天平(型號(hào)CPA，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、磁力攪拌器(型號(hào)T8-1，江蘇省金壇市中大儀器廠)、酶標(biāo)儀(型號(hào)mμlISKANMK3，Thermo) 、離心機(jī)(型號(hào)HI650，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.3 配藥及干預(yù)方法 先稱量大鼠體重，按不同組別計(jì)算出所需3-MA藥物總劑量，然后將3-MA用PBS溶液配成濃度為10 mg/ml的藥液，現(xiàn)配現(xiàn)用。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)期間每天稱量大鼠體重，根據(jù)大鼠體重A、B、C組分別按10、15、30 mg/kg劑量腹腔注射3-MA;D組注射等劑量PBS溶液，左右腹腔交替注射,干預(yù)3個(gè)療程,每個(gè)療程5 d,療程期間休息2 d,共計(jì)19 d;E組不做任何處理為空白對(duì)照組;G組按30 mg/kg劑量腹腔注射3-MA,在適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后的第1個(gè)療程的第1天注射1次，然后其它療程不做任何處理，僅喂養(yǎng)至干預(yù)結(jié)束，共19 d。F組按30 mg/kg劑量腹腔注射3-MA，分別在每個(gè)療程的第1天注射1次，共3次，其余時(shí)間不做任何處理至干預(yù)結(jié)束,共19 d，第20天取材。

1.4 觀察指標(biāo) P62和LC3蛋白表達(dá)：將大鼠麻醉處死后，迅速剪取胃竇組織一塊，置于凍存管中，保存在-80 ℃冰箱待檢測。用Western blot方法檢測胃竇組織中LC3和P62的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 相同時(shí)間不同劑量3-MA干預(yù)后胃竇組織P62和LC3的相對(duì)表達(dá) ①P62相對(duì)表達(dá)量：A、D、E三組兩兩對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；與D、E組相比，B、C組P62表達(dá)增加(均P<0.05)；C組P62表達(dá)高于B組(P<0.05)、A組(P<0.01)。②LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值：D、E組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；A組(P<0.05)、B組(P<0.05)、C組(P<0.01)的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值均低于D、E組；C組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值低于B組(P<0.05)、A組(P<0.01)；B組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值低于A組(P<0.05)。見表1(圖1)。

圖1 各組大鼠LC3、P62蛋白表達(dá)電泳圖

表1 各組大鼠P62蛋白及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值

2.2 相同劑量3-MA干預(yù)不同時(shí)間后胃竇組織P62和LC3的相對(duì)表達(dá) ①P62相對(duì)表達(dá)量：各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；C組的P62表達(dá)明顯高于F組、G組(均P<0.01)，G組的P62表達(dá)明顯高于F組(P<0.01)。②LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值：各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；G組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值高于F組、C組(均P<0.01)；C組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值高于F組(P<0.05)。見表2(圖2)。

表2 各組大鼠P62蛋白及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值

圖2 各組大鼠LC3、P62蛋白表達(dá)電泳圖

3 討 論

細(xì)胞自噬可能被饑餓、生長因子缺乏、高生物能量需求、氧化應(yīng)激、感染、蛋白質(zhì)聚集物積累、營養(yǎng)狀況、溫度、氧氣濃度、細(xì)胞密度等多種因素誘導(dǎo)發(fā)生，其過程大致分為三步[17]，最初的步驟包括隔離膜的形成(囊泡成核)和擴(kuò)張(囊泡伸長)，這也被稱為吞噬體。吞噬體膜的脂質(zhì)來源尚不清楚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和線粒體都有可能是其來源[18]。然后，吞噬體的邊緣融合(囊泡完成)形成自噬小體，這是一個(gè)隔離細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)的雙層膜結(jié)構(gòu)。隨后自噬小體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，其中的內(nèi)容被降解成更小的物質(zhì)成分，這一過程為細(xì)胞提供了自我更新所需的營養(yǎng)和材料。LC3Ⅰ 位于細(xì)胞質(zhì)，LC3Ⅱ 則位于自噬小體膜上，自噬過程中，LC3Ⅰ 經(jīng)泛素樣加工修飾后，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3Ⅱ并聚集在自噬體膜上。隨著自噬小體的形成，細(xì)胞質(zhì)中處于游離狀態(tài)的LC3Ⅰ逐漸轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，從而LC3Ⅱ在自噬體膜的表達(dá)會(huì)逐漸增加[19-20]，所以LC3Ⅱ含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比，而LC3Ⅱ與LC3Ⅰ 的比值大小通常被用于評(píng)估自噬激活的程度，是判斷自噬水平高低的依據(jù)[21-22]。P62也稱為SQSTM，可通過UBA和LIR結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合泛素化底物及自噬小體，將待降解底物轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬溶酶體系統(tǒng)。在自噬過程中，P62發(fā)揮著重要作用，它不僅作為泛素化蛋白的接頭蛋白，也作為底物溶酶體降解。因此，在生理?xiàng)l件下基礎(chǔ)水平的自噬可以維持P62處于一個(gè)較低的濃度水平[23]。如果自噬小體和溶酶體發(fā)生融合功能障礙，自噬被抑制，溶酶體不能順利降解P62，P62就會(huì)積聚，P62的數(shù)量會(huì)增加[24-25]。3-MA是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制劑，PI3K是一種能磷酸化磷脂酰肌醇的脂激酶，在眾多控制mTOR激活的信號(hào)通路中，它是胰島素等生長因子應(yīng)答的關(guān)鍵元素。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，有三類PI3K：Ⅰ類PI3K、Ⅱ類PI3K、Ⅲ類PI3K。3-MA不僅抑制Ⅰ類PI3K，也抑制Ⅲ類PI3K，作為PI3K抑制劑，3-MA可以間接阻斷其下游AKT的激活[26]，也可以通過抑制由Beclin1和Vps34組成的復(fù)合物即Ⅲ類PI3K而抑制雙膜泡的形成，并阻止這些自噬體吞噬細(xì)胞成分，進(jìn)而影響微管相關(guān)蛋白1輕鏈β(LC3b)定位于細(xì)胞膜，從而抑制自噬[10]。在本研究實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠精神狀態(tài)較好、活動(dòng)自如、飲食正常，均未出現(xiàn)藥物注射異常反應(yīng)，可見大鼠對(duì)3-MA腹腔適應(yīng)性較好。

本研究發(fā)現(xiàn)，在使用不同劑量3-MA腹腔注射干預(yù)相同時(shí)間后，其自噬抑制效果存在明顯差異。結(jié)合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62的檢測結(jié)果分析，在腹腔注射相同時(shí)間15 d情況下，隨著3-MA劑量的增加，大鼠胃竇組織中P62的表達(dá)升高，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的值下降，且3-MA組與PBS組和空白對(duì)照組差異明顯。說明10、15、30 mg/kg劑量的3-MA腹腔注射均有抑制大鼠胃竇組織細(xì)胞自噬的作用，其中 30 mg/kg劑量組自噬抑制效果優(yōu)于10、15 mg/kg劑量組。另外，在腹腔注射相同劑量3-MA 30 mg/kg的前提下，干預(yù)不同時(shí)間1、3、15 d，其自噬效果也存在差異。結(jié)合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62的檢測結(jié)果，其中干預(yù)15 d組的P62相對(duì)表達(dá)最高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值低，且P62與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值相差較明顯，說明用3-MA 30 mg/kg劑量干預(yù)15 d自噬抑制效果優(yōu)于1 d組、3 d組。但本研究尚存在一定的局限，因?yàn)槭穷A(yù)實(shí)驗(yàn)，所以樣本數(shù)量較小，且本課題組在查閱相關(guān)文獻(xiàn)后僅選取了3個(gè)劑量梯度及3個(gè)時(shí)間階段，濃度及時(shí)間的選取無法做到全面。而且曾有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證明3-MA在自噬的調(diào)節(jié)中具有雙重作用，雖然它能夠抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬，但它在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中的長期處理會(huì)誘導(dǎo)自噬[27]。所以在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中是否存在比30 mg/kg劑量自噬抑制效果更好的更高劑量以及比干預(yù)15 d自噬抑制效果更好的干預(yù)持續(xù)時(shí)間，尚待進(jìn)一步研究。

綜上,用3-MA直接給大鼠進(jìn)行腹腔注射可以抑制大鼠胃竇組織細(xì)胞自噬，3個(gè)劑量組中30 mg/kg為3-MA腹腔注射抑制大鼠胃竇組織細(xì)胞自噬的最佳藥物劑量，腹腔注射干預(yù)15 d自噬抑制效果最強(qiáng)。