多次輸血尿毒癥患者免疫抗-Jk3引起輸血無效及家系分子生物學研究①

龔晨輝 饒美英 周 芬 余 玲 胡 芬 葉水文 (江西省南昌大學第二附屬醫院，南昌 330006)

Kidd血型系統誘導的同種免疫抗體是除ABO、Rh系統外引起溶血性輸血反應的主要同種抗體，其血型抗原是SLC14A1基因的產物，也是紅細胞膜上尿素轉運蛋白。正常紅細胞表達Jka或Jkb抗原，當SLC14A1基因發生變異時，可以使Jka或Jkb抗原性消失，并導致紅細胞對尿素轉運能力下降。因此，在傳統血清學中，以2 mol/L尿素與樣本紅細胞反應15 min 后不溶血作為Jknull表型的篩選方法。Jknull血型經同種免疫后易產生高頻抗原抗體即抗-Jk3，該抗體與所有正常表達Jka或Jkb抗原的紅細胞發生凝集。近年，國內外少有此抗體引起溶血性輸血反應的報道，因此本課題組對患者及其家庭成員的Kidd血型進行血型血清學檢測與分子生物學分析，研究Jknull表型的分子機理和遺傳背景，為此類稀有血型患者輸血提供相關科學依據，同時提示需要長期輸血患者的檢測手段與建議，現報道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 患者，女，51歲，尿毒癥病史2年。因發熱、頭暈3 d，伴昏迷半天入院治療，親屬敘述無輸血治療史。1 d：入院血常規檢查Hb:42 g/L，申請濾白懸浮紅細胞2U，膽紅素未見異常。輸血前檢測: O型，Rh(D)陽性，抗體篩查陰性；隨著患者多次輸注異體紅細胞后，直抗陽性逐漸增強(凝集強度越大代表效價越高);交叉配血實驗結果：主側陰性，次側陽性。21 d: 因當地配血困難，尋求上級醫院會診。其他輸血相關信息見表1。

1.1.2試劑和儀器 抗人球蛋白(抗IgG、抗C3d)檢測卡(微柱凝膠法)、抗人球蛋白(抗IgG+C3d)檢測卡(柱凝集法)、不規則抗體篩選紅細胞試劑均為江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司產品；譜細胞、抗人球蛋白(抗IgG)、抗-Jka標準血清、抗-Jkb標準血清均為美國Immucor公司產品；酸放散試劑為珠海貝索生物技術有限公司產品；尿素為西隴科學股份有限公司產品，所有試劑均按試劑說明書進行操作。離心機 (KA-2200)為日本久保田公司產品；全血DNA提取試劑盒、人類紅細胞稀有血型基因分型試劑盒、SLC14A1基因測序試劑盒均為江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司產品；自動化核酸提取設備(Gene Pure Plus)、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測系統(LineGene 9600 Plus)均為杭州博日科技有限公司產品。

1.2方法

1.2.1血清學檢測 按照《全國臨床檢測操作規程》對標本進行血型鑒定、不規則抗體鑒定等檢測[1]。直抗陽性樣本按酸放散說明書進行檢測。

1.2.2分子生物學分析 運用磁性微珠分離技術，采用全血DNA提取試劑盒在自動化核酸提取設備完成基因組純化。JKA/JKB 基因分型使用人類紅細胞稀有血型基因分型試劑盒，采用熒光溶解曲線法技術。Kidd基因擴增與測序分析使用Kidd測序科研試劑盒進行PCR序列特異性引物與測序引物進行分析，測序結果使用Geneious序列判讀軟件，將結果與參比序列(Jk*01)進行對比分析。

2 結果

2.1先證者輸血記錄與檢驗結果 患者輸血前后血紅蛋白(Hb)、總膽紅素(TBI)、直接膽紅素(DBI)、間接膽紅素(IBI)檢測值變化見圖1。

2.2血清學試驗結果 21 d樣本進行毛細管離心，近心端與遠心端樣本的直接抗人球蛋白分型、2 mol/L 尿素溶解試驗、標清定型結果見表1。

2.3不規則抗體篩選與鑒定 患者血漿樣本抗篩陽性，抗體鑒定結果為高頻抗體、與所有譜細胞均為4+凝集，與患者經毛細管離心后近心端樣本不凝集。酸放散液與所有譜細胞均2+凝集，與患者經毛細管離心后近心端樣本不凝集。

2.4分子生物學分析 所有家系成員含先證者基因分型結果皆為Jk(a-b+)。先證者測序結果為：341+12CT，342-1GA，222CA，499AG，588GG，838AA;先證者丈夫測序結果為: 499GG，588GG，838AA;先證者子代測序結果為:341+12CT、342-1GA、499AG、588GG、 838AA，測序結果見圖2。根據測序結果進行先證者等位基因分析，其一等位基因為:341+12C>T，342-1G>A，588 A>G，838G>A，另一等位基因為：222C>A，499 A>G，588A>G，838G>A。先證者子代攜帶先證者等位基因(341+12C>T，342-1G>A，588A>G，838G>A)，見圖3。

圖1 先證者入院后的實驗室數據和輸血記錄Fig.1 Proband′s lab data and transfusion record since admit to hospitalNote:IAT.indirect coombs test， DAT.direct coombs test,Major.crossm-atch major compatible， Minor.crossmatch minor compatible， LPR.leukocyte poor RBC，WRBC.washed RBC，0.Negtive;1+.agglutinating cells are in the middle and lower part of gel card;2+.agglutination cells were found in the upper,middle and lower parts of gel cards;3+.agglutination in the upper and middle part of the gel card;4+.agglutination at the top of the gel card (the higher the agglutination intensity,the higher the titer);dcp.double cell population.

表1 毛細管離心后的直抗、2 mol/L尿素和Kidd表型結果

圖2 先證者的SLC14A1序列結果Fig.2 SLC14A1 sequence result in proband

圖3 先證者的遺傳家系圖譜Fig.3 Molecular pedigree analysis of proband

3 討論

有輸血史患者一旦產生高頻抗體，便不易與自身抗體區分，因為近期患者體內輸入的獻血員紅細胞與患者免疫刺激生成的同種抗體發生凝集導致直抗陽性。先證者在高頻抗體產生前Hb從42 g/L上升至輸血后52 g/L，顯示此時輸血有效，但后續輸血由于先證者近期密集輸血與直抗陽性，將高頻抗體誤判為自身抗體[2-3]。先證者在住院第13天、20天、21天輸血后未見Hb明顯上升，且膽紅素在1 d 內急劇升高，由此提示獻血員紅細胞在患者體內大量破壞，考慮患者出現由同種抗體或合并自身抗體導致的遲發型溶血性輸血反應[4]。經毛細管離心試驗處理樣本后，患者新生成紅細胞不與患者血漿發生凝集且直抗陰性，由此進行高頻抗體分析[5-6]。

中國人群的高頻抗體頻率占所有紅細胞免疫抗體頻率0.05%以下，以抗-Jk3、抗-Dib、抗-P1PPk相對常見。Kidd血型刺激產生的抗體在血漿中可能迅速下降至很低或不能被檢測的水平，給該類抗體檢測帶來一定困難[7-10]。但在過去的案例報告中，抗-Jk3不乏嚴重和致命的急性溶血性輸血反應，也有遲發型溶血性輸血反應的案例報導[11-13]。抗-Jk3僅發生在Jk(a-b-)(又稱Jknull)表型人群，波利尼亞和芬蘭人的Jk(a-b-)頻率約為0.1%～1.4%，亞洲地區日本約為0.002%，我國開展的稀有血型篩查計劃報導新疆維吾爾地區少數民族Jk(a-b-)頻率為0.0063%、番禺地區50 034例無償獻血者中發現10例Jk(a-b-)，頻率為0.02%，深圳地區兒童Jk(a-b-)頻率為0.0196%，48 400上海地區人群中發現2例Jk(a-b-)，頻率為0.0041%。

Kidd血型系統為SLC14A1基因產物，由11個外顯子構成。JKA與JKB基因多態性由G838A決定第280個氨基酸為天冬氨酸形成Jka抗原、天冬酰胺形成Jkb抗原。Jknull表型的分子機制中以342-1G>A相對常見，舊稱IVS5-1，該位點突變位于內含子5最后一個堿基，導致RNA剪切酶無法結合，使6外顯子全片段缺失[14]。在本實驗的家系調查中，先證者與其子代都發生該位點突變。而先證者另一導致Jknull的堿基突變為222C>A，即第74個氨基酸從天冬酰胺變賴氨酸。

綜上所述，對長期多次輸血患者進行嚴格執行輸血前后效評價，可早期發現由輸血刺激產生的同種抗體，為患者后續制定合理有效的輸血策略提供依據[15-16]。雖然先證者為尿毒癥患者，缺少Hb及肌酐等腎功能損害關鍵指標無法體現，但仍可從輸血后膽紅素的急劇上升發現患者存在大量紅細胞破壞現象。對于需要長期多次輸血患者需進行多抗原檢測及抗體篩查，可保障該類患者輸血安全，提升用血質量[17]。