細(xì)胞外核苷酸對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用①

王秋吉 楊啟鑫 柴艷敏 單春華

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

核苷酸是核酸的組成成分，隨著核酸分布于生物體內(nèi)各器官、組織、細(xì)胞核及胞質(zhì)中，參與生物體的遺傳、發(fā)育、生長(zhǎng)等基本生命活動(dòng)。核苷酸不僅在細(xì)胞內(nèi)具有重要作用，在細(xì)胞外空間同樣發(fā)揮重要作用。一定條件下細(xì)胞會(huì)主動(dòng)釋放核苷酸到胞外空間，或在組織受損時(shí)泄露到胞外空間，這類核苷酸稱為胞外核苷酸[1]。胞外核苷酸的濃度由定位于細(xì)胞膜的磷酸水解酶調(diào)節(jié)。不同濃度的胞外核苷酸，特別是胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)與不同的嘌呤受體相互作用調(diào)節(jié)多種生理和病理過(guò)程，是廣泛調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等功能的重要信號(hào)[2]。免疫細(xì)胞也會(huì)主動(dòng)釋放ATP，且?guī)缀跛忻庖呒?xì)胞都表達(dá)嘌呤受體。胞外ATP在炎癥、凋亡或壞死等條件下濃度升高，作為危險(xiǎn)相關(guān)模式分子調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，發(fā)揮二次信號(hào)作用[3]。胞外ATP可以有效調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dentritic cells,DCs)、中性粒細(xì)胞、酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的生理功能，與細(xì)胞遷移、趨化性、細(xì)胞因子釋放、細(xì)胞成熟、細(xì)胞毒性等過(guò)程相關(guān)[4]。

1 胞外核苷酸的釋放及濃度調(diào)節(jié)

胞外核苷酸的釋放有主動(dòng)釋放和被動(dòng)釋放兩種方式。主動(dòng)釋放受多種因素調(diào)節(jié)，通過(guò)胞吐作用和質(zhì)膜通道完成，而被動(dòng)釋放不受控制，是由細(xì)胞膜破裂造成的。

細(xì)胞受到刺激活化或發(fā)生凋亡時(shí)，可通過(guò)胞吐作用主動(dòng)釋放ATP，如神經(jīng)元細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等將ATP儲(chǔ)存在細(xì)胞囊泡中，囊泡與細(xì)胞膜融合將內(nèi)容物釋放到胞外空間，通過(guò)胞吐作用主動(dòng)釋放ATP[5]。細(xì)胞也可以通過(guò)離子通道和孔道兩種質(zhì)膜通道主動(dòng)釋放ATP[6]。離子通道蛋白主要有大離子通道蛋白和體積調(diào)節(jié)型離子通道蛋白。內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤細(xì)胞及多種免疫細(xì)胞在滲透性腫脹和缺氧期間通過(guò)大離子通道蛋白主動(dòng)釋放ATP，受到滲透性腫脹刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也通過(guò)體積調(diào)節(jié)型離子通道主動(dòng)釋放ATP。參與細(xì)胞主動(dòng)釋放ATP的孔道蛋白有泛素和連接蛋白兩種。免疫細(xì)胞在受到缺氧或細(xì)胞凋亡的刺激時(shí)，會(huì)通過(guò)泛素主動(dòng)釋放ATP[6]。而細(xì)胞膜去極化、胞外Ca2+濃度降低和促炎因子刺激時(shí)，可誘導(dǎo)血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞等通過(guò)定位于非質(zhì)膜連接區(qū)域的連接蛋白通道主動(dòng)釋放ATP。同一細(xì)胞可以同時(shí)通過(guò)多種途徑主動(dòng)釋放ATP[6]。而細(xì)胞壞死時(shí)，由于細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)部的DNA、RNA等泄露到胞外空間，被水解為胞外核苷酸。

釋放于胞外的核苷酸濃度受酶調(diào)節(jié)，參與胞外核苷酸和核苷濃度調(diào)節(jié)的酶主要有堿性磷酸酶、胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶家族(ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase，e-NTPDases)、堿性磷酸酶和5′-外核苷酸酶(ecto-50-nucleotidase，NT5E/CD73)、外核苷酸焦磷酸酶(ecto-nucleotide pyrophosphatases，ENPPs)、腺苷脫氨酶、NAD糖水解酶、CD38/NADase、二核苷酸聚磷酸水解酶、腺苷酸激酶、核苷二磷酸激酶和潛在的胞外-F1-fo ATP合成酶[7]。e-NTPDases、堿性磷酸酶和CD73主要調(diào)節(jié)胞外ATP的濃度[7]。 e-NTPDases中主要發(fā)揮作用的是NTPDases 1、2、3和 8。 NTPDase1也稱為CD39在各種淋巴細(xì)胞和靜息血管內(nèi)皮上表達(dá)。CD39和堿性磷酸酶具有同樣的功能，可以將胞外ATP水解為ADP和AMP。CD73進(jìn)一步將AMP水解成腺苷，腺苷通過(guò)腺苷脫氨酶降解為肌苷或通過(guò)核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)[6]。ENPPs也是代謝胞外核苷酸的重要水解酶，可以水解ATP、GTP、UTP和CTP生成對(duì)應(yīng)核苷以及磷酸和焦磷酸，也可以水解UDP-sugars生成UMP和sugar-1P，還可以水解煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、ADP核糖和二核苷酸多磷酸鹽[7]。

2 胞外核苷酸受體

胞外核苷酸與不同的嘌呤受體(purines receptors,P受體)結(jié)合，啟動(dòng)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。P受體包括2個(gè)家族：識(shí)別腺苷的P1受體和主要識(shí)別ATP、ADP、UTP和UDP 的P2受體[4]。

P1受體是G蛋白偶聯(lián)受體，有4個(gè)亞型分別是高親和力受體A1、A2A和低親和力受體A2B、 A3。P1受體有腺苷酸環(huán)化酶活性，調(diào)節(jié)環(huán)狀A(yù)MP(cyclic AMP，cAMP)。A2A和A2B激活腺苷酸環(huán)化酶，而A1和A3抑制腺苷酸環(huán)化酶。中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表達(dá)P1受體，影響cAMP的生成[3]。

P2受體有配體門控離子通道型受體(P2X受體) 和G 蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y受體)2種類型。P2X受體是以ATP為唯一配體的質(zhì)膜通道，介導(dǎo)細(xì)胞中多種陽(yáng)離子的流入或流出如Na+、K+、Ca2+，在人類和嚙齒動(dòng)物中共有7種亞型P2X1～P2X7。P2X受體以三聚體的方式排列在離子通道周圍，與3個(gè)ATP結(jié)合打開離子通道，誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶途徑等的激活[3]。P2Y受體以ATP、ADP、UTP、UDP和UDP-sugars為配體(表1)，激活后可以調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶磷脂酶C和離子通道等信號(hào)傳導(dǎo)途徑，有8種亞型：P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13和P2Y14[4]。

3 胞外核苷酸對(duì)免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)

不同的胞外核苷酸與特定免疫細(xì)胞表達(dá)的不同受體結(jié)合發(fā)揮不同作用。胞外ATP與巨噬細(xì)胞的P2X受體相互作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或增強(qiáng)吞噬作用。胞外核苷酸對(duì)DCs功能的調(diào)節(jié)受濃度和刺激時(shí)間的影響。胞外ATP對(duì)中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的趨化性和遷移具有調(diào)節(jié)作用。胞外ATP對(duì)自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞和T細(xì)胞的活性及穩(wěn)定性具有調(diào)節(jié)作用。

3.1胞外核苷酸對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié) 巨噬細(xì)胞具有攝取處理外來(lái)物質(zhì)和壞死細(xì)胞的吞噬功能，同時(shí)還可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與抗原呈遞和免疫調(diào)節(jié)。胞外ATP可以刺激巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子或增強(qiáng)其吞噬作用以適應(yīng)外部微環(huán)境的改變。

胞外ATP與巨噬細(xì)胞上的P2X7受體結(jié)合使K+外流，觸發(fā)NLRP3(natch domain-,leucine-richrepeat-,PYD-containing protein 3，NLRP3)炎癥小

表1 P2Y受體及其配體

體聚集[8]，NLRP3炎癥小體促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶1前體成為有活性的半胱氨酸蛋白酶1，將IL-1β前體和IL-18前體轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞因子[9]。敲除小鼠巨噬細(xì)胞表面的P2X7受體，NLRP3炎癥小體、IL-1β和IL-18分泌減少[10]。胞外ATP通過(guò)與P2X7受體相互作用也可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，激活胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和半胱氨酸蛋白酶1，加工IL-1β前體和IL-18前體[11]。此外毫摩爾濃度的胞外ATP還可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1α、IL-6、TNF-α[4]。低摩爾濃度的胞外ATP與P2Y11受體相互作用，通過(guò)依賴于cAMP的蛋白激酶A或由cAMP直接激活的交換蛋白直接或間接增加cAMP負(fù)向調(diào)節(jié)反應(yīng)，抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生并同時(shí)上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)[12]。細(xì)胞凋亡時(shí)釋放少量的胞外核苷酸與巨噬細(xì)胞的P2X1受體或P2X3受體相互作用，上調(diào)整合素1和波連蛋白受體在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞與凋亡小體的結(jié)合能力，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[13]。而細(xì)胞壞死時(shí)泄露的大量胞外核苷酸只刺激巨噬細(xì)胞的促炎活性不增強(qiáng)其吞噬作用。抑制胞外ATP與巨噬細(xì)胞的嘌呤受體結(jié)合，可顯著降低HIV病毒的復(fù)制率[3]。

3.2胞外核苷酸對(duì)DCs的調(diào)節(jié) 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是激活T細(xì)胞最有效的抗原呈遞細(xì)胞。DCs的激活是啟動(dòng)先天免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同濃度胞外核苷酸及不同刺激持續(xù)時(shí)間對(duì)DCs的影響是不同的，低濃度的胞外ATP促進(jìn)DCs成熟并遷移到淋巴結(jié)，刺激T細(xì)胞分化。高濃度胞外ATP增強(qiáng)DCs的促炎活性。其他胞外核苷酸也可以調(diào)節(jié)DCs的功能[4]。

低濃度的胞外ATP慢性刺激可促進(jìn)DCs成熟，增強(qiáng)募集Th2細(xì)胞的能力，引發(fā)2型免疫應(yīng)答。胞外ATP與其他刺激DCs成熟的因子如細(xì)菌內(nèi)毒素、脂多糖等共同存在時(shí)，IL-1b、IL-1a、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子-α的表達(dá)受到抑制，IL-1受體拮抗劑和IL-10的表達(dá)不受影響，從而增強(qiáng)T輔助細(xì)胞的分化能力[14]。胞外ATP也會(huì)影響DCs趨化因子受體的表達(dá)。胞外ATP與DCs相互作用下調(diào)炎癥趨化因子如CC趨化因子受體5的受體，上調(diào)淋巴趨化因子如CXC趨化因子受體4和CC趨化因子受體7[15]。淋巴趨化因子的上調(diào)有利于淋巴結(jié)定位及增強(qiáng)DCs與T細(xì)胞相互作用的能力。此外胞外ATP也影響DCs分泌趨化因子。胞外ATP促進(jìn)DCs分泌淋巴趨化因子CCL22，抑制磷酸酯多糖刺激的炎癥趨化因子CXCL10和CCL5的分泌[15]。趨化因子釋放的轉(zhuǎn)變有利于Th2的募集。因此長(zhǎng)期低濃度胞外ATP對(duì)DCs，的成熟具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)活性，通過(guò)增強(qiáng)DCs在淋巴結(jié)中的定位能力和募集Th2細(xì)胞，從而啟動(dòng)2型免疫反應(yīng)。高濃度胞外ATP和細(xì)菌病原體共同刺激DCs，胞外ATP加速IL-1b前體的成熟，顯著提高DCs的促炎活性[16]。

胞外UDP通過(guò)抑制脂多糖誘導(dǎo)的核因子-κB 的激活，抑制 DCs 的成熟及分泌IL-12、IL-23，從而抑制了DCs 介導(dǎo)的 Th1 和 Th17 細(xì)胞的分化，緩解自身免疫性疾病[17]。胞外ADP抑制DCs的成熟和吞噬功能，UTP促進(jìn)DCs釋放細(xì)胞因子[18]。

3.3胞外核酸對(duì)的中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié) 中性粒細(xì)胞是高速運(yùn)動(dòng)的吞噬細(xì)胞，可以快速?gòu)难貉h(huán)中遷移，負(fù)責(zé)入侵微生物的初始清除，是先天性免疫重要的效應(yīng)細(xì)胞。胞外核苷酸對(duì)中性粒細(xì)胞細(xì)胞遷移、分泌細(xì)胞因子、凋亡及吞噬功能具有調(diào)節(jié)作用。在炎癥細(xì)胞應(yīng)激/損傷/死亡血小板聚集刺激下產(chǎn)生的N-甲酰基肽激活中性粒細(xì)胞表面的甲酰肽受體，使中性粒細(xì)胞通過(guò)泛素連接蛋白1或連接蛋白43釋放ATP[18]。這一部分胞外ATP與其他細(xì)胞釋放的胞外ATP共同作用于中性粒細(xì)胞表面的P2Y2受體，打開Ca2+通道聚集肌動(dòng)蛋白，促進(jìn)中性粒細(xì)胞向損傷部位遷移。同時(shí)作為受到脂多糖刺激的Toll樣受體的第二階段反應(yīng)，刺激中性粒細(xì)胞分泌IL-8，分泌的IL-8反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)其他中性粒細(xì)胞的趨化性[19]。胞外ATP也會(huì)作用于中性粒細(xì)胞表面的P2Y11受體延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡周期[20]。胞外ATP和ADP激活巨噬細(xì)胞表面分子，刺激中性粒細(xì)胞的吞噬作用，也會(huì)在病原體刺激之前抑制中性粒細(xì)胞的吞噬功能[21]。這種抑制作用在抑制噬血細(xì)胞綜合征等病理?xiàng)l件下發(fā)生的過(guò)度吞噬作用有重要意義。

嗜酸性細(xì)胞是粒細(xì)胞白細(xì)胞，可以從循環(huán)中募集到炎癥區(qū)域，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。嗜酸性粒細(xì)胞可以由尿酸鈉晶體誘導(dǎo)釋放自分泌ATP，這些自分泌胞外ATP作為正反饋信號(hào)與嗜酸性粒細(xì)胞上的P2受體相互作用。胞外ATP調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及其趨化性和遷移。胞外UTP和ADP以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞快速、短暫地聚合肌動(dòng)蛋白，調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥組織遷移[22]。胞外ATP與人嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)的P2Y2受體結(jié)合，釋放嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、IL-6、IL-8，與P2X1，P2X7和P2Y6受體相互作用釋放IL-8[4]。此外胞外ATP與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的P2Y2受體相互作用可以調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的趨化性。胞外ATP與定位于內(nèi)皮細(xì)胞的P2Y2受體相互作用，使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子1。血管細(xì)胞黏附分子1與嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)的α4β1整合素結(jié)合，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的遷移和黏附[22]。

3.4胞外核苷酸對(duì)淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié) 胞外ATP可以調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞(T helper cells，Th細(xì)胞)的增殖和CD62L的釋放。在應(yīng)激信號(hào)刺激和主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類與T細(xì)胞受體結(jié)合的共同作用下，Th細(xì)胞通過(guò)泛素1釋放ATP。自分泌的胞外ATP與Th細(xì)胞表達(dá)的P2X1、P2X4和P2X7受體作用，調(diào)節(jié)IL-2的分泌和Th細(xì)胞的增殖[23]。胞外ATP與P2X7受體集合還可以促進(jìn)Th細(xì)胞釋放CD62L[4]。CD62L的釋放與T細(xì)胞活化有關(guān)[4]。

胞外ATP調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的穩(wěn)定性及維持免疫耐受性。IL-6促進(jìn)調(diào)節(jié)型T細(xì)胞釋放ATP。自分泌的胞外ATP與調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的P2X7受體結(jié)合，促進(jìn)調(diào)節(jié)型T細(xì)胞分化為分泌IL-17的Th17細(xì)胞[24]。主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類與調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的T受體結(jié)合后，上調(diào)特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，增強(qiáng)了CD39的表達(dá)，促進(jìn)胞外ATP的水解生成腺苷，腺苷激活T細(xì)胞表達(dá)的A2受體抑制IL-2的產(chǎn)生，使活化的調(diào)節(jié)型T細(xì)胞以自體方式消除P2X7介導(dǎo)的功能和穩(wěn)定性的抑制[25]。而胞外ATP與P2X7受體結(jié)合后可以抑制特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，抑制調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的抑制潛能和穩(wěn)定性，維持免疫耐受性[4]。胞外ATP上調(diào)參與免疫抑制和耐受的凝血酶敏感素-1和吲哚胺2，3-雙加氧酶的表達(dá)，凝血酶敏感素-1下調(diào)IL-12，抑制T細(xì)胞增殖，負(fù)調(diào)節(jié)獲得性免疫[20]。GTP和核苷濃度的改變也會(huì)抑制T細(xì)胞增殖[26]。

胞外ATP是NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)劑，即可以抑制NK細(xì)胞的增殖和IFN-Y的分泌[24]。又可以阻斷趨化因子(C-X3-C基序)配體1(CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1)介導(dǎo)的NK細(xì)胞毒性和趨化性。胞外ATP與NK細(xì)胞表面的P2Y11受體相互作用增加趨化因子和對(duì)趨化因子(C-X-C基序)配體12[chemokine (C-X-C motif) ligand 12，CXCL12]的趨化性，同時(shí)抑制CX3CR1誘導(dǎo)的趨化性和NK細(xì)胞殺傷能力[25]。胞外UDP通過(guò)抑制IL-15激活雷帕霉素靶蛋白(m-TOR) 信號(hào)通路，影響Th1細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制 NK 細(xì)胞殺傷能力[16]。胞外ATP和相關(guān)的腺嘌呤核苷酸在降低NK細(xì)胞毒性中發(fā)揮作用。胞外ATP通過(guò)抑制NK細(xì)胞增殖，抑制NK細(xì)胞對(duì)K562靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性。細(xì)胞外ATP還可以通過(guò)激活P2Y11受體調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性[25]。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，核苷酸不僅是核酸的基本單位，也在胞外空間調(diào)節(jié)細(xì)胞間信息交流。胞外核苷酸與P2受體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移、增殖、分化和釋放多種炎癥介質(zhì)。炎癥條件下，細(xì)胞不僅應(yīng)激或死亡后被動(dòng)釋放核苷酸，也會(huì)通過(guò)非溶解機(jī)制主動(dòng)釋放核苷酸。在免疫系統(tǒng)中胞外核苷酸是損傷相關(guān)模式分子，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、DCs、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能。炎癥和免疫反應(yīng)在多種人類疾病中起關(guān)鍵作用，而胞外核苷酸又可以調(diào)節(jié)炎癥和免疫應(yīng)答。胞外核苷酸是治療多種疾病重要的藥理學(xué)靶標(biāo)，同時(shí)P2受體靶向藥物也為治療炎癥疾病提供了潛在治療劑。對(duì)于胞外核苷酸調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答機(jī)制的深入研究具有深遠(yuǎn)的生物學(xué)和藥理學(xué)意義。