基于TCGA數據庫研究NUF2基因在肝細胞癌中的表達及臨床意義①

米寧寧 林延延 曹 潔 張金鐸 岳 平 孟文勃

(蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高死亡率的原發性肝癌，占所有類型肝癌的90%以上，近年發病率明顯上升[1]。全球范圍內超過50%肝癌發生在中國，且東南沿海地區發病率最高。HCC發生發展的主要因素包括肝硬化、病毒性肝炎、黃曲霉素和化學致癌物等，其中，慢性肝炎病毒感染是最重要因素[2-3]。對于無肝硬化和轉移的HCC患者，肝切除是目前首選且最有效的方法[4]。但大部分患者就診時已處于晚期，常合并并發癥及伴有遠處轉移，無法徹底治愈，需根據腫瘤特點、并發癥、腫瘤部位和臨床表現等多種因素綜合分析并進行微創治療，包括射頻消融術、微波消融術、經肝動脈化療栓塞和肝動脈放療性栓塞、基因分子靶向治療如索拉菲尼等[5-6]。血清甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是當前HCC診斷常用指標，但仍有約30%的HCC患者AFP水平正常。因此，深入研究HCC發生發展的分子機制，尋找高靈敏度的生物學標記物對HCC早期診斷及預后預測具有重要意義。細胞分裂相關基因NUF2具有穩定著絲粒和保證染色體正確分離的作用，可保證細胞有絲分裂過程正常進行[7]。當腫瘤組織中NUF2異常表達，運動蛋白無法形成紡錘體微管附件，紡錘體裝配檢查點無法被激活，導致染色體分離異常，從而影響正常有絲分裂過程[8]。本研究使用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數據集分析NUF2基因在正常肝組織與HCC中的表達差異、與HCC患者臨床病理特征的相關性及其與HCC預后的相關性，為進一步研究HCC的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1數據來源 從TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)數據庫下載HCC的mRNA表達譜數據，包含50例正常肝組織和374例HCC組織，同時下載其臨床相關資料，采用R軟件和Perl語言預處理數據。

1.2數據集篩選和差異表達分析 剔除TCGA數據集中臨床病理參數不完整及缺乏預后隨訪資料的樣本，僅保留同時包含臨床參數和生存數據的樣本，利用Wilcoxon秩和檢驗確定NUF2基因在正常肝組織和HCC組織中的表達差異，采用R軟件(3.5.2)的“limma”軟件包完成差異分析并繪制差異散點圖[9]。

1.3生存分析與臨床相關性分析 根據樣本中NUF2基因表達的中位值將NUF2分為高表達組和低表達組，采用R軟件的“survival”軟件包進行生存分析，采用“survminer”軟件包繪制生存曲線，單因素和多因素Cox風險模型分析臨床參數與HCC預后的關系并計算風險比(hazard ratio,HR)。

1.4基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA) 采用GSEA軟件(4.0.2)(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)進行富集分析[10]。采用GSEA網站的MsigDB數據庫獲取c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt數據集，設置分析置換次數為1 000次,顯著富集基因集需滿足以下條件：錯誤發現率(false discovery rates,FDR)<0.25,P<0.05。

2 結果

2.1NUF2在和正常肝組織和HCC組織中的表達差異 HCC組織中NUF2表達顯著高于正常肝組織(P<0.05)，見圖1。

2.2NUF2基因表達與臨床病理特征相關性分析 NUF2表達與HCC患者預后呈顯著相關，見圖2。

HCC患者5年生存率分別為高表達組37.9%、低表達45.3%。NUF2表達與HCC患者年齡、臨床分期、腫瘤分級及T分期顯著相關(P<0.05)，與M分期、N分期相關性無統計學意義(P>0.05)，見圖3。單因素Cox分析提示病理分期、T分期、M分期及NUF2基因表達水平與HCC預后相關，進一步進行多因素Cox分析，結果顯示NUF2高表達是影響HCC患者預后的獨立危險因素。見表1。

2.3GSEA分析 GSEA分析結果表明，NUF2基因高表達組HCC樣本主要富集于細胞周期、PPAR信號通路、GNRH信號通路(圖4)。提示NUF2基因可能參與HCC發生發展的多個生物學過程。

圖1 HCC組織和正常肝組織中NUF2 mRNA表達Fig.1 Expression of NUF2 mRNA in HCC tissue and normal liver tissue

圖2 NUF2基因mRNA表達與HCC患者預后的相關性Fig.2 Correlation of NUF2 mRNA expression and prognosis in HCC patients

圖3 NUF2表達與臨床病理特征的關系Fig.3 Relationship between expression of NUF2 and clinicopathological characteristics

圖4 GSEA分析NUF2相關富集基因集Fig.4 GSEA analysis of NUF2 relatied enriched gene set with high expression of NUF2

3 討論

HCC是目前最常見肝臟腫瘤之一，嚴重影響人們的生命健康，肝切除是目前治療HCC的首選和最有效方法，但大部分HCC患者就診時已處于晚期，且常合并并發癥或伴有遠處轉移，無法手術根治，因此，尋找新的分子標志物和治療靶點有望改善HCC患者預后。本研究采用TCGA肝癌數據庫分析正常肝組織與HCC組織中NUF2基因表達差異并分析其表達與預后的關系，發現NUF2高表達組預后明顯差于低表達組，單因素、多因素Cox分析表明NUF2基因可作為HCC患者的獨立預后因素。GSEA分析結果提示NUF2基因高表達組HCC樣本主要富集于細胞周期、PPAR信號通路、GNRH信號通路等。

細胞分裂相關基因NUF2作為NDC80復合體的重要組成部分,參與動粒-微管黏附，涉及細胞有絲分裂和腫瘤發生發展的重要過程，腫瘤組織中NUF2異常表達可誘導有絲分裂細胞異常并導致細胞死亡，從而導致腫瘤[11-12]。研究發現NUF2可促進細胞生長并抑制HCC細胞凋亡[13]。一項針對人骨肉瘤Saos-2細胞的研究表明，沉默NUF2表達可抑制人骨肉瘤Saos-2細胞增殖，有望成為靶向治療早期治療骨肉瘤的新策略[14]。通過siRNA干擾沉默技術抑制NUF2基因表達，結果表明NUF2低表達可顯著降低肝癌HCCLM3細胞遷移和侵襲[15]。

綜上所述，HCC組織中NUF2基因高表達，且與臨床病理特征相關，可能是HCC診斷和治療的潛在生物標志物。本研究的優勢在于利用TCGA數據庫中肝細胞癌的測序數據，納入樣本多，臨床資料比較完整，為后續研究NUF2基因在HCC中的發生機制及相關臨床研究提供依據。但不能完全代表NUF2在蛋白水平的表達，后續將采用qPCR、Western blot和免疫組織化學法驗證NUF2的表達情況，進一步研究其作用機制，為HCC的基因靶向治療提供新思路。