lncRNA ZFAS1靶向miR-193a-3p調控宮頸癌細胞Siha放射敏感性的分子機制研究

劉曉娟 王 靜 張 娟 高月月 王 虹

(河北北方學院附屬第一醫院婦產科，張家口 075000)

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，放射治療是其主要治療手段之一，放射治療的效果與其放射敏感性密切相關，而臨床上部分患者放射治療效果不理想，對放射不敏感是其主要原因[1-2]。研究宮頸癌放療敏感性的相關機制對克服宮頸癌患者的放療耐受及延長患者生存期具有重要意義。有報道顯示，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)廣泛參與宮頸癌的發生發展，且lncRNA可作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)與miRNA競爭性結合，調節宮頸癌細胞的增殖、侵襲、遷移、轉移和放療敏感性[3-4]。鋅指蛋白反義鏈1(zinc finger antisense 1，ZFAS1)是lncRNA家族中的一員，是多種腫瘤中的致癌分子，lncRNA ZFAS1通過調控BMI1和ZEB2促進調節骨肉瘤的生長和轉移[5]。沉默ZFAS1通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌SGC7901細胞的生長、增殖、遷移、侵襲和上皮-間質轉化，并增強了對順鉑或紫杉醇的敏感性[6]。miR-193a-3p的異常表達與多種腫瘤的發生發展有關。研究發現miR-193a-3p通過靶向LOXL4基因和氧化應激途徑調節膀胱癌的多藥耐藥性[7]。miR-199a-3p在宮頸癌組織中低表達，而miR-199a-3p對宮頸癌細胞放射敏感性的影響及ZFAS1是否通過miR-199a-3p影響宮頸癌細胞放射敏感性尚不明確[8]。本實驗旨在研究ZFAS1對宮頸癌細胞放射敏感性的影響及其機制是否與miR-199a-3p有關，為宮頸癌放射治療的敏感性提供新思路和新靶點。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1組織來源 收集2015年1月至2019年1月就診于本院并確診為宮頸癌的患者134例，放射敏感組為3個月內或局部復發在放療12個月內未出現局部殘留病變的患者；放射抵抗組為原發腫瘤或發生轉移不完全消退大于3個月的患者及放射治療后12個月內原發病灶和轉移病灶均有局部復發的患者。兩組患者均于放療后進行手術切除，其中放射敏感組和放射抵抗組各67例。

1.1.2細胞與試劑 宮頸癌細胞Siha購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、DMEM培養購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告實驗檢測試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、BCA試劑盒、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天公司；60Co醫療照射裝置購自中國核動力研究院。

1.2方法

1.2.1細胞培養 宮頸癌細胞Siha用含10% FBS的DMEM培養基于37℃、5% CO2的恒溫箱培養，每2～3 d換液一次，細胞融合至80%左右時進行消化傳代。

1.2.2細胞轉染和分組 實驗分為pcDNA組、pcDNA-ZFAS1組、si-con組、si-ZFAS1組、IR+si-con組、IR+si-ZFAS1組、si-ZFAS1+anti-miR-con組、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組、IR+si-ZFAS1+anti-miR-con組、IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組。

pcDNA組、pcDNA-ZFAS1組、si-con組、si-ZFAS1組：將pcDNA、pcDNA-ZFAS1、si-con、si-ZFAS1質粒分別轉染至Siha細胞；IR+si-con組、IR+si-ZFAS1組：將si-con組、si-ZFAS1組細胞用4 Gy 射線照射；si-ZFAS1+anti-miR-con組、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組：將anti-miR-con、anti-miR-193a-3p質粒分別與si-ZFAS1共轉染至Siha細胞；IR+si-ZFAS1+anti-miR-con組、IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組：將si-ZFAS1+anti-miR-con組、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組細胞用4 Gy射線照射。

1.2.3qRT-PCR分析miR-193a-3p和lncRNA ZFA-S1表達水平 分別用0、2、4、6、8 Gy的60Co射線照射宮頸癌細胞Siha，繼續培養24 h后提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書進行PCR反應。循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。miR-193a-3p和lncRNA ZFAS1的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。宮頸癌放射敏感組織和放射抵抗組織及其他各組細胞按上述方法檢測miR-193a-3p和ZFAS1表達水平。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 收集以上各組細胞提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。蛋白經SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次(10 min/次)后于暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，膠片采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白相對表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集以上各組細胞，用不含EDTA的胰酶消化后，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。按照試劑盒說明書進行檢測，實驗重復3次。

1.2.6細胞克隆集落形成實驗 取對數生長期si-con組、si-ZFAS1組、si-ZFAS1+anti-miR-con組、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組細胞，消化后以適中密度接種于直徑為60 mm的培養皿，細胞融合達到80%左右，用60Co醫療裝置分別給予0、2、4、6、8 Gy 的射線照射。照射后，接種于60 mm培養皿繼續培養10～14 d。PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數>50個細胞的集落?？寺⌒纬陕?planting efficiency，PE)=克隆數/接種細胞數×100%，存活分數(survival fraction，SF2)=照射劑量組的集落數/(該組細胞接種數×未照射組PE)。采用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，SF2=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D為照射劑量(Gy)，D0為平均致死劑量，Dq為準閾劑量(代表存活的肩寬度)，N為外推值。放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)=單純照射組D0/聯合照射組D0。

1.2.7熒光素酶報告基因檢測實驗檢測ZFAS1對miR-193a-3p的靶向調控 Starbase預測顯示ZFAS1與miR-7-5p存在結合位點。構建野生型和突變型基因靶點ZFAS1的熒光素酶表達載體(WT-ZFAS1和MUT-ZFAS1)，用Primer 3.0設計引物序列，WT-ZFAS1 F：5′-CCGCTCGAGTACACTATTGGCCAGTT-3′，R：5′-GAATGCGGCCGCTGAAGTGGGCACAGCC-TTTTA-3′；MUT-ZFAS1 F：5′-CCGCTCGAGTACACTATTCCGGTCAT-3′，R：5′-GAATGCGGCCGCTGAA-GTGGGCACAGCCTTTTA-3′。加粗的分別為XhoⅠ，NotⅠ酶切位點序列，之前為保護堿基，進行PCR擴增，反應體系為30 μl，擴增條件為95℃預變性5 min 進入擴增循環，循環條件為94℃ 1 min，60℃ 30 s；72℃ 45 s，共40個循環；72℃延長5 min。產物經電泳后切膠回收，回收的PCR產物和pmir-RB-REPORTTM載體分別用XhoⅠ，NotⅠ進行雙酶切，然后連接PCR產物與載體，產物與載體比例為3∶1，連接反應產物轉化100 μl大腸桿菌感受態DH5α，將用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切正確的產物重組載體送測，測序正確的用于實驗。取對數生長期Siha細胞接種于24孔板(1×103個/孔)，待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將miR-con和miR-193a-3p的質粒分別與WT-ZFAS1和MUT-ZFAS1共轉染至Siha細胞，按說明書進行操作，檢測細胞熒光素酶活性。

2 結果

2.1宮頸癌細胞組織和Siha中lncRNA ZFAS1和miR-193a-3p的表達 與放射敏感組織相比，放射抵抗組織中ZFAS1表達水平顯著升高，miR-193a-3p表達水平顯著降低(P<0.05)；不同輻射劑量照射宮頸癌細胞Siha后，ZFAS1表達水平顯著升高，miR-193a-3p表達水平顯著降低(P<0.05，圖1)。

2.2沉默lncRNA ZFAS1促進宮頸癌細胞Siha凋亡 沉默ZFAS1及ZFAS1聯合4 Gy射線照射后，ZFAS1表達水平顯著降低，Cleaved Caspase-3表達水平顯著升高，Cyclin D1表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05，圖2)。表明沉默ZFAS1聯合4 Gy射線可促進細胞凋亡。

2.3沉默ZFAS1增加宮頸癌細胞Siha放射敏感性 單擊多靶模型擬合計算得出，si-con組和si-ZFAS1組的D0值分別為2.50和1.69，si-ZFAS1組放射增敏比為1.48(表1)；在同一劑量照射下，si-ZFAS1照射組的細胞克隆形成數及存活分數明顯低于si-con照射組；沉默ZFAS1及ZFAS1聯合4 Gy射線照射后，Siha中γ-H2AX表達水平顯著升高(P<0.05，圖3)。提示沉默ZFAS1可增加宮頸癌細胞Siha的放射敏感性。

2.4lncRNA ZFAS1靶向miR-193a-3p Startbase數據庫預測顯示ZFAS1與miR-193a-3p存在結合位點(圖4A)；相較于miR-con組，miR-193a-3p組轉染WT-ZFAS1載體的宮頸癌細胞Siha的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染MUT-ZFAS1載體的宮頸癌細胞Siha的熒光素酶活性差異無統計學意義(圖4B)。相較于si-con組，si-ZFAS1組Siha細胞中miR-193a-3p的表達水平顯著升高；相較于pcDNA組，pcDNA-ZFAS1組Siha細胞中miR-193a-3p表達水平顯著降低(P<0.05，圖4C)。提示ZFAS1可靶向調控miR-193a-3p表達。

圖1 宮頸癌組織和Siha細胞中lncRNA ZFAS1和miR-193a-3p的表達水平Fig.1 Expressions of lncRNA ZFAS1 and miR-193a-3p in cervical cancer tissue and Siha cellNote:Compared with radiosensitive tissue,*.P<0.05 ;compared with 0 Gy group,#.P<0.05.

圖2 沉默lncRNA ZFAS1對宮頸癌細胞Siha凋亡及相關蛋白的影響Fig.2 Effect of silencing lncRNA ZFAS1 on apoptosis and related proteins in cervical cancer cell SihaNote:1.si-con;2.si-ZFAS1;3.IR-si-con;4.IR+si-ZFAS1.*.P<0.05 vs si-con group；#.P<0.05 vs IR+si-con group.

2.5抑制miR-193a-3p表達逆轉對沉默ZFAS1對宮頸癌細胞Siha的抑制作用 沉默ZFAS1聯合4 Gy射線照射后Siha中miR-193a-3p、Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表達水平顯著升高，Cyclin D1表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；沉默ZFAS1和miR-193a-3p及聯合4 Gy射線照射后，Siha中miR-193a-3p、Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表達水平顯著降低，Cyclin D1表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05，圖5)。提示抑制miR-193a-3p表達逆轉對沉默lncRNA ZFAS1對宮頸癌細胞Siha的凋亡促進作用。

表1 沉默lncRNA ZFAS1對宮頸癌細胞Siha放射后單擊多靶模型擬合的參數值

圖3 不同劑量下宮頸癌細胞Siha存活曲線和4 Gy劑量下γ-H2AX蛋白表達

單擊多靶模型擬合計算顯示(表2)，si-ZFAS1組和si-ZFAS1+ anti-miR-193a-3p組的放射增敏比分別為1.34和0.79；在同一劑量照射下，IR+si-ZFAS1組的存活率明顯低于IR+si-con組，而IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p 組存活率明顯高于IR+si-ZFAS1+anti-miR-con組。提示抑制miR-193a-3p表達可逆轉對沉默ZFAS1對宮頸癌細胞Siha的放射增敏作用。

圖4 lncRNA ZFAS1與miR-193a-3p的靶向關系Fig.4 Targeting relationship between lncRNA ZFAS1 and miR-193a-3pNote:*.P<0.05 vs miR-con group；Δ.P<0.05 vs si-con group；#.P<0.05 vs pcDNA group.

圖5 宮頸癌細胞Siha存活曲線、凋亡率及Caspase-3、Cyclin D1、γ-H2AX蛋白的表達

表2 沉默ZFAS1對宮頸癌細胞Siha放射后單擊多靶模型擬合的參數值

3 討論

放療廣泛應用于宮頸癌的臨床治療，使部分患者得到了較好的治療，但輻射抗性的出現使宮頸癌患者放療后出現復發和轉移，逆轉宮頸癌輻射抵抗、提高腫瘤治愈率是目前臨床亟待解決的難題[9]。研究表明，在多種腫瘤放射治療前后，部分lncRNA異常表達，可能通過調控細胞周期影響腫瘤細胞的放療敏感性[10]。ZFAS1是一種新的腫瘤相關的lncRNA，敲除ZFAS1可以增強非小細胞肺癌細胞對新型分子靶向藥物安羅替尼的敏感性[11-12]。ZFAS1還與卵巢癌患者的鉑類化療敏感性相關[13]。ZFAS1過表達通過引起細胞周期停滯和誘導乳腺癌細胞凋亡而顯著抑制細胞增殖[14]。本實驗結果顯示，宮頸癌放射抵抗組織和不同劑量射線照射后的宮頸癌細胞中ZFAS1高表達，沉默ZFAS1促進宮頸癌細胞凋亡并增加細胞放射敏感性。H2AX是組蛋白H2A家族成員之一，可作為電離輻射后DNA雙鏈斷裂損傷的標志，其表達量的變化可反應細胞的放射敏感性[15]。而Cleaved Caspase-3是細胞凋亡調控蛋白，其高表達促進細胞凋亡，Cyclin D1則通過阻滯細胞周期抑制細胞增殖。本實驗結果顯示沉默ZFAS1促進Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表達，抑制Cyclin D1表達。進一步說明沉默ZFAS1促進宮頸癌細胞凋亡，增強其放射敏感性。

有研究顯示，miR-193a-3p通過抑制Cyclin D1表達將細胞周期阻滯在G1期，進而抑制細胞增殖[16]。本實驗中抑制miR-193a-3p逆轉了沉默ZFAS1對Cyclin D1表達的抑制作用，提示其可促進腫瘤細胞增殖。此外，研究發現miR-193a-3p是非小細胞肺癌放療敏感性相關的miRNA之一[17]。miR-193a-3p在食管癌放射耐受細胞中高表達，抑制其表達細胞放射敏感性增加，促進放射耐受細胞凋亡[18]。miR-193a-3p在肺癌中發揮腫瘤抑制劑的作用，miR-193a-3p通過調控下游基因ERBB4增加肺癌細胞放射敏感性[19]；miR-193a-3p在多藥耐受細胞SKOV-3中高表達，參與調節卵巢癌細胞多藥耐受[20]。本實驗結果顯示，miR-193a-3p在放射抵抗宮頸癌組織和射線照射的宮頸癌細胞中低表達，抑制miR-193a-3p表達逆轉了沉默ZFAS1對宮頸癌細胞的放射增敏和細胞凋亡促進作用，且ZFAS1靶向調節miR-193a-3p表達。說明lncRNA ZFAS1可能通過控miR-193a-3p影響宮頸癌細胞的放射敏感性。

綜上所述，lncRNA ZFAS1可增加宮頸癌細胞的放射敏感性并促細胞凋亡，其機制可能與調控miR-193a-3p有關，可為宮頸癌的放療提供新靶點和新思路。