花姜酮通過調節E6/E7蛋白表達和上皮間質轉化抑制宮頸癌HeLa細胞①

王慧玲 劉珊珊 楊 君 (新鄉醫學院第一附屬醫院婦科，衛輝 453100)

宮頸癌常與人類乳頭瘤病毒(human papilloma-virus，HPV)感染有關[1]。常見致癌的HPVs，如HPV-16和HPV-18，可引發宮頸癌。HPV病毒基因組進入宿主細胞，病毒蛋白E6/E7的表達促進宮頸的癌變和惡性生長[2]。E6和E7 HPV癌蛋白的表達是其致癌性的關鍵因素，也可能影響其毒性，包括轉移轉化。病毒E6和E7基因的表達對HPV的轉化活性至關重要[3]。病毒E6和E7癌蛋白維持著HPV陽性宮頸癌細胞的成瘤表型[4]。花姜酮(zerumbone，ZER)是一種在亞熱帶生姜中發現的一種單萜烯，對包括宮頸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和結腸癌在內的幾種腫瘤細胞系具有抑制作用[5-9]。然而，尚未有研究闡明ZER與E6和E7癌蛋白是否存在調控關系。本文旨在研究ZER對宮頸癌的作用及其可能的潛在機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與試劑 人宮頸癌細胞株HeLa、C4-1、SiHa 和 Caski購自美國ATCC； DMEM培養基、10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 g/ml)購自美國Gibco公司，生化標準品ZER(純度≥98% HPLC)、二甲基亞砜(DMSO)、coaktail、苯甲磺酰氟(PMSF)、Hoechst 33342染料購自Sigma-Aldrich公司；聚偏二氧乙烯膜(polyvinyvidene fluoride，PVDF)膜購自美國Millipore公司；抗體：兔抗人anti-Vimentin、anti-GAPDH、anti-Ki67、anti-caspase-3、anti-VEGF、anti-MMP14、anti-Ecadherin、anti-Twist1、anti-zeb1、anti-N-cadherin單抗購自美國Abcam公司；anti-Snail1單抗購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)偶聯山羊抗兔二抗多抗購自美國Santa Cruz 生物技術公司； chemdoc xRS成像系統和Quantity One分析軟件購自美國Bio-Rad Laboratories公司；酶標儀購自美國BioTek Instruments公司。

1.1.2實驗動物 20只7周齡雌性BALB/c無胸腺裸鼠，體重150～180 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0012。小鼠處于housedin氣候控制條件下，并可以自由進食和飲水。動物的飼養環境是12 h的明/暗循環，恒溫為(22±1)℃，濕度為55%±5%。

1.2方法

1.2.1細胞培養和異位異種移植瘤模型建立 HeLa細胞培養于含10%FBS、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 g/ml)的DMEM培養基中，每隔2 d換新鮮培養基，當HeLa細胞幾乎長滿整個培養瓶底部時，用胰酶消化傳代或收集細胞。使用雌性BALB/c無胸腺的裸鼠進行造模。將1×106個HeLa細胞(100 μl)通過皮下注射植入BALB/c裸鼠，7 d內出現異種移植瘤代表模型建立成功。為檢測ZER對異種移植瘤的影響，將裸鼠分為對照組和處理組，每組8只，參考ABDUL等[10]的研究方法，將對照組和處理組裸鼠分別予以等體積生理鹽水和16 mg/kg ZER進行腹腔注射，3 d/次，持續32 d，于最后1 d測量腫瘤體積后，處死動物用于后續實驗。

1.2.2CCK-8測定細胞活力 本研究采用CCK-8法檢測ZER的細胞毒性以及HeLa細胞的增殖情況。毒性試驗：用不同濃度ZER(0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L) 處理HeLa 細胞48 h，收集細胞，酶標儀檢測490 nm處吸光度值。為了檢測ZER對HeLa 細胞增殖的影響，處理組和對照組HeLa 細胞分別用2.5 μmol/L ZER和未加ZER的培養基處理，分別于0 h、24 h、48 h、96 h時收集細胞，檢測細胞懸液490 nm處吸光度值。

1.2.3Hoechst 33342染色 收集HeLa細胞并重懸于含2% FBS 的DMEM培養基中，密度1×106個/ml。根據制造商說明書用Hoechst 33342染色溶液37℃下孵育HeLa細胞60 min。最后，在熒光顯微鏡下觀察細胞。隨機選取6個區域，計算濃縮細胞核細胞數(出現藍色光亮熒光)，測定凋亡細胞占總細胞的比例。

1.2.4Western blot分析 HeLa 細胞分別用2.5 μmol/L ZER和對照溶液處理48 h，收集兩組細胞；收集2組小鼠腫瘤并勻漿腫瘤組織。采用添加coaktail和PMSF的RIPA裂解緩沖液提取蛋白。蛋白質(40 μg)上樣到SDS-PAGE(6%～12%)中電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜。脫脂牛奶封閉2 h后，經過1∶1 000工作濃度的兔抗人一抗單抗孵育過夜，之后再經過1∶5 000工作濃度的山羊抗兔二抗多抗繼續孵育2 h，去離子水漂洗后采用HRP-ECL發光法進行曝光顯影，采用Image J軟件通過蛋白條帶灰度值分析蛋白的相對表達量。

1.2.5Transwell法檢測ZER對HeLa細胞侵襲能力的影響 將HeLa (5×104個/200 μl)細胞接種在含無血清DMEM的Transwell小室上室中，下室加入500 μl含10%FBS的DMEM新鮮培養基，同時，上室和下室均加入2.5 μmol/L ZER。培養24 h后，用95%乙醇固定下室細胞并用蘇木精染色，統計下室細胞數目，即為侵襲細胞數。

1.2.6免疫組化 取2組小鼠腫瘤組織進行固定石蠟包埋，制成切片保存。切片經過脫蠟復水處理，首先用3%過氧化氫在37℃下處理10 min進行脫色處理。然后，用10%羊血清在37℃封閉30 min。隨后，在4℃冰箱孵育抗caspase-3和抗Ki67抗體12 h。次日，用PBS漂洗3次，每次10 min，接著在室溫下孵育二抗30 min，然后加入顯色試劑3，30-二氨基苯胺，用光學顯微鏡觀察陽性棕色細胞并拍照。

1.3統計學分析 采用SPSS16.0軟件對實驗數據進行統計學分析。所有數據組間分析采用TWO-WAY ANOVA；列分析采用ONE-WAY ANOVA和t檢驗。以P<0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1E6/E7蛋白在宮頸癌細胞中高表達 如圖1所示，E6/E7在正常宮頸癌上皮細胞Ect1/E6E7中呈低表達；與Ect1/E6E7相比，E6/E7在宮頸癌細胞系HeLa、C4-1、SiHa 和 Caski中表達明顯上升(P<0.01)。

2.2ZER抑制宮頸癌細胞活力 如圖2 所示，ZER以濃度依賴的方式抑制宮頸癌細胞活力。5 μmol/L ZER處理時，細胞活力為80%。而大于該濃度表現出明顯細胞毒性，因此本研究采用最大抑制效果而無明顯細胞的毒性的5 μmol/L作為后續ZER處理細胞的濃度，且選擇HeLa細胞作為宮頸癌細胞的代表。

2.3ZER抑制宮頸癌HeLa細胞增殖 如圖3A所示，與對照組相比，ZER明顯抑制HeLa細胞增殖(P<0.01)；ZER顯著下調增殖標記蛋白Ki67和PCNA的表達(P<0.01，圖3B)，驗證了ZER對HeLa細胞的增殖抑制作用。

2.4ZER促進宮頸癌HeLa細胞凋亡 如圖4A所示，ZER明顯增加HeLa細胞凋亡比例(P<0.01)，ZER顯著上調凋亡標記蛋白cleaved caspase-3的表達(P<0.01,圖4B)，驗證了ZER對HeLa細胞凋亡的促進作用。

2.5ZER抑制宮頸癌HeLa細胞侵襲 如圖5A所示，ZER明顯減少HeLa細胞侵襲數目(P<0.01)，ZER顯著下調轉移標記蛋白MMP-14的表達(P<0.01，圖5B)，驗證了ZER對HeLa細胞侵襲的抑制作用。

圖1 Western blot檢測E6/E7蛋白表達水平Fig.1 Western blot for detecting protein expressions of E6/E7Note:Compared with Ect1/E6E7,**.P<0.01.

圖2 CCK-8檢測ZER對宮頸癌細胞活力的影響Fig.2 CCK-8 for detecting effect of ZER on cell viability of cervical cancer cells

圖3 ZER抑制宮頸癌HeLa細胞增殖Fig.3 ZER inhibited cell proliferation of HeLa cellNote:Compared with control,**.P<0.01.

圖4 ZER促進宮頸癌HeLa細胞凋亡

圖5 ZER抑制宮頸癌HeLa細胞侵襲

圖6 ZER抑制宮頸癌HeLa 細胞EMT和E6/E7表達Fig.6 ZER inhibited protein expressions of EMT and E6/E7 pathways in HeLa cellNote:Compared with control,**.P<0.01.

圖7 ZER抑制小鼠宮頸癌生長Fig.7 ZER inhibited cervical cancer tumor growth in miceNote:Compared with control,**.P<0.01.

圖8 ZER下調HeLa移植瘤中Ki67蛋白表達，上調caspase-3表達Fig.8 ZER downregulated protein expressions of Ki67 and upregulated protein expressions of caspase-3 in HeLa xenograftNote:Compared with control,**.P<0.01;scale bar=100 μm.

2.6ZER抑制宮頸癌HeLa 細胞EMT和E6/E7表達 如圖6所示，ZER明顯下調促EMT的蛋白如Vimentin、Snail、和N-cadherin表達，上調逆轉EMT的蛋白E-cadherin表達(P<0.01)；同時，ZER明顯下調E6/E7表達(P<0.01)。

2.7ZER體內抑制小鼠宮頸癌生長 如圖7A所示，處理組腫瘤體積明顯小于對照組(P<0.01)；ZER處理后腫瘤質量也比對照組低(P<0.01)。

2.8ZER下調HeLa移植瘤中Ki67蛋白表達，上調caspase-3表達 如圖8所示，處理組腫瘤組織Ki67蛋白表達明顯被ZER抑制(P<0.01)，而caspase-3表達明顯被ZER誘導(P<0.01)。

3 討論

宮頸癌是由HPV感染引起的。大多數HPV感染是無害和自發清除的，但持續的高危HPV感染(特別是16型和18型)可導致宮頸癌[1，11-12]。E6/E7蛋白是篩查和診斷中國人群宮頸癌前病變和宮頸癌的潛在標志物[13]。研究表明，E6可誘導抑癌蛋白p53的降解，而E7則干擾視網膜母細胞瘤抑癌蛋白的活性[14-15]。抑制HPV陽性癌細胞中的E6/E7蛋白會導致抑癌途徑重新激活。例如，研究表明，抑制E6主要導致癌細胞凋亡，而聯合抑制E6/E7則可使癌細胞生長抑制[16-17]。本文研究表明，在HPV-16型宮頸癌細胞SiHa 和 Caski以及HPV-18型宮頸癌細胞HeLa 和 C4-1中，E6/E7蛋白均呈高表達狀態。說明E6/E7表達與宮頸癌有直接的關系，抑制E6/E7表達可能抑制宮頸癌的發展。

ZER是1956年從Z.zerumbet rhizomes根莖揮發油中分離得到的第一個化合物[5]。ZER的抗癌作用已被廣泛研究。ZER可誘導癌細胞凋亡。例如，ZER被報道參與抑制卵巢癌和宮頸癌細胞IL-6并誘導細胞凋亡和細胞周期暫停[5]；與上述文獻一致，本研究表明ZER可促進HeLa細胞凋亡，抑制HeLa細胞增殖。ZER可抑制癌細胞轉移。例如，ZER通過抑制IL-8和MMP-3在人三陰性乳腺癌細胞中的表達從而抑制IL-1β誘導的細胞遷移和侵襲[18]；ZER通過MAPK信號通路抑制肝癌HepG2細胞的生長和轉移[19]；本研究中Transwell 實驗證明ZER抑制HeLa細胞侵襲，抑制MMP-14表達。

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT)是一個涉及胚胎發生、組織再生和腫瘤進展的可逆生物學過程[20]。在原發性腫瘤中，E-cadherin等上皮標志物減少，N-cadherin、vimentin、Snail等間質標志物增多，可促進腫瘤的侵襲轉移[21-22]。研究表明，ZER可抑制結腸癌細胞EMT過程[23]。本研究表明，ZER上調E-cadherin，下調N-cadherin、vimentin、Snail表達，證明ZER可抑制HeLa細胞EMT過程。本研究證明ZER可抑制HeLa細胞E6/E7蛋白的表達。同時，本研究結果初步表明ZER可能通過抑制胞E6/E7蛋白的表達和EMT從而抑制HeLa細胞生長和轉移。本研究體內實驗驗證了ZER的抗腫瘤作用。

綜上所述，ZER可能通過抑制胞E6/E7蛋白的表達和EMT抑制HeLa細胞生長和轉移，促進宮頸癌細胞凋亡，同時抑制體內腫瘤的生長。