一個單純型甲基丙二酸血癥家系的MUT基因突變分析

陳璐 金一幫 童郁 潘麗琴 李陽陽 施建有 戴顯寧 蔡曉曉 許鍇

甲基丙二酸血癥（methylmalonic aciduria，MMA）又稱甲基丙二酸尿癥，為常染色體隱性單基因遺傳病，也是一種常見的有機酸血癥，發病率一般為1/48 000～1/250 000[1]。該病主要是由于甲基丙二酰輔酶A變位酶（methylmalonyl-CoA mutase，MCM）自身缺陷或其輔酶腺苷鈷胺素（Ado-Cbl）代謝缺陷所致[2]，使甲基丙二酰輔酶A向琥珀酰輔酶A轉換過程受阻；該酶的缺乏導致血液中甲基丙二酸及其相關有機酸增高，甲基丙二酸、甲基丙二酰肉堿、丙酸、甲基枸櫞酸等中間代謝產物體內異常蓄積，進而引起肝、腎、腦等多臟器損傷，致死率、致殘率高[3-4]。MMA臨床表型及基因型復雜，至今已發現7種致病變異基因，分別是MMACHC、MUT、MMAA、MMAB、HCFC1、SUCLG1、SUCLA2 型，在我國以 MMACHC基因變異引起的MMA合并同型半胱氨酸血癥最為多見，MUT基因變異引起的單純型MMA次之[5]。筆者對1例單純型MMA患兒進行早期干預診療，同時對該家系進行基因檢測，以預防缺陷患兒再出生，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 MMA先證者為2018年12月溫州市人民醫院新生兒科收治的1例足月產男嬰，氣促5 h，呻吟不安，擬“呼吸困難，肌張力低下”收住入院。其父母此前生育過1例疑似MMA病男嬰，出生10余天夭折。患兒入院后檢驗指標顯示頑固性酸中毒PCO226 mmHg，HCO3-5.9 mmol/L；低血糖 0.7 mmol/L，高血氨 126 μmol/L，高乳酸16 mmol/L。顱腦MRI檢查顯示雙側枕部及天幕硬膜下血腫。對夫婦進行遺傳咨詢，雙方非近親婚配，否認有家族性遺傳病史。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 遺傳代謝疾病檢測 采集患兒指尖靜脈血，滴于專用濾紙片上陰干送檢。采用串聯質譜儀（美國ABI公司API4000型）對共22種氨基酸、55種酰基肉堿進行檢測。采集患兒尿濾紙片標本，安裝新生兒尿袋留取新鮮尿液5ml，將尿液倒入無菌治療碗中，將尿滲透濾紙浸潤自然干燥后送檢。采用氣相色譜質譜儀（美國ABI公司API3200型）對尿液中的132種有機酸、氨基酸等代謝化合物進行檢測。

1.2.2 DNA提取和全外顯子測序 采集患兒靜脈血2 ml于EDTA抗凝管中，用QIAampDNA Blood MiniKi（t德國Qiagen公司）試劑盒提取基因組DNA，Qubit 2.0（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行DNA定量。取0.5 μg患兒樣本DNA用超聲儀（BioruptorNGS）隨機打斷成200 bp片段，用Truseq DNA Sample Preparation試劑盒處理兩端連接測序接頭構建文庫，使用Roche Nimblegen SeqCap EZ v5.1試劑盒捕獲全外顯子區域，采用Illumina XTEN平臺進行高通量測序分析查找可疑病因。

1.2.3 Sanger測序驗證 針對致病MUT基因的突變位點所在外顯子區域設計PCR上下游引物，以患兒及其父母的基因組DNA為模板進行PCR反應，用Sanger測序法進行驗證。PCR反應產物電泳后由ABI3730完成一代測序；查看Sanger測序峰圖（Chrmos軟件），比對Sanger測序結果（SeqMan軟件）展開驗證。

1.2.4 突變致病性預測分析 對基因突變的致病性進行預測，將人類與其他種屬的MCM氨基酸序列進行物種保守性比對分析。針對突變位點分析MUT基因突變前后由氨基酸變化引起的蛋白質空間結構的改變，初步闡明突變位點致病的可能機制。生物信息分析預測選用Polyphen-2、SIFT、Clustal X 和 Swiss-PdbViewer軟件。

2 結果

2.1 遺傳代謝疾病檢測 患兒血丙酰基肉堿13.61 mol/L（參考值 0.35～4.20 mol/L），丙酰肉堿/乙酰肉堿 0.85 μM（參考值 0.03～0.20 μM）；尿液檢測甲基丙二酸為116.81 μM（參考值 0.2～3.6 μM），甲基枸緣酸為 3.65 μM（參考值0～1 μM），均顯著高于正常參考值。

2.2 基因測序結果 本例患兒MUT基因為復合雜合突變：（1）c.1280 G＞A（p.Gly427Asp）（編碼區第 1280 號核苷酸由鳥嘌呤變異為腺嘌呤），導致氨基酸改變p.Gly427Asp（錯義突變）。患兒母親該位點為雜合變異，父親無變異。（2）c.1677-1G＞A（p.?）（外顯子的最后一個堿基位于編碼區1677位，該外顯子相鄰前方的內含子的第一個堿基由鳥嘌呤變異為腺嘌呤）為剪切突變，不屬于多態性位點。患兒父親該位點存在變異，母親無變異。患兒及其父母MUT基因測序見圖1。

2.3 基因突變的生物信息學分析 查詢dbSNP、Hapmap、千人基因組計劃等數據庫，未發現MUT基因c.1280G＞A具有多態性的可能。Polyphen-2軟件對這個變異的預測分數為1，提示突變為有害突變（圖2a），SIFT軟件的預測分數均為-5.942（圖2b），提示“有損害的”。Clustal X軟件通過對5個人類同源物種的MCM蛋白進行保守性比對，結果 p.Gly427Asp高度保守（圖3），提示這個位點具有重要的生物學功能。

2.4 突變結構和模型分析 應用Swiss-Pdb Viewer軟件進行模型構建和突變后相互作用對比分析當非極性氨基酸Gly427突變為極性氨基酸Asp427后，Asp427側鏈延長，增加一個與Thr78蘇氨酸的氫鍵作用力（圖4a、b）。

圖1 患兒及其父母MUT基因部分序列測序結果（a、b、c、d分別是野生型序列、母親、患兒和父親測序結果）

圖2 p.G427A突變致病性分析圖（a：PolyPhen-2軟件預測分數設定在0～1，預測分數越接近1，越可能為有害突變；b：PROVEAN軟件預測結果有害的）

圖3 人427位Gly與不同動物比較

圖4 蛋白三維構象分析（a：427位氨基酸野生型；b：427位氨基酸突變型；虛線為氫鍵）。

3 討論

MMA是一種常見的有機酸代謝遺傳病，臨床癥狀為代謝性酮癥酸中毒，拒食、呼吸困難及生長發育遲緩等導致新生兒早期死亡或兒童期嚴重的神經功能障礙[6]。國內MMA患者60%～80%以MMACHA基因突變引起的合并型MMA居多，cblC缺陷是主要病因[7-8]；其次為單純型MMA，其中MUT基因是最常見突變類型[9]。MUT基因定位于6p21，全長約35 kb，內含13個外顯子。MCM酶由MUT基因編碼[10]，是由兩個相同亞基組成的同源二聚體，每個亞基包含32個氨基酸前導序列的750個氨基酸多肽鏈，進入線粒體后前導鏈立即被切除，裝配成718個氨基酸的亞單位，每個亞單位包含兩個主要的功能結合區：底物結合區（第86～423位氨基酸組成）和鈷胺素結合區（第578～750位氨基酸組成），兩個結合區之間被稱為連接區（第424～577氨基酸組成），具有關閉8 barrel結構域的功能。第33～85氨基酸序列參與MCM亞單位二聚體化。本研究對1例經血液、尿液氣相色譜/質譜串聯檢查高度懷疑為甲基丙二酸血癥的新生兒家系進行了二代測序分析發現患兒患單純型MMA，MUT基因檢測存在兩處變異，分別為第6號外顯子G427A錯義突變，第9號內含子c.1677-1G＞A的剪切突變，為復合雜合變異。首先研究查詢國內外相關數據庫，排除這兩個為多態性位點，用SIFT和Polyphen2軟件進行G427A錯義突變致病性分析為致病突變位點，并提供了氨基酸同源序列保守性分析，蛋白結構分析方法預測了突變位點帶來的致病性改變。G427A的錯義突變位于MCM酶結構連接區其改變了氨基酸的空間構象進而影響蛋白功能，這與Liu等[9]報道相符合，且該位點為我國南方常見突變位點[10-11]。其次，內含子剪切位點的突變可造成剪切位點破壞和識別異常，引起前體mRNA的剪切，從而造成基因的異常轉錄。根據剪切位點位置的不同對外顯子所造成的剪切效應也不同，突變位于外顯子上游-1bp和-2bp或+1bp和+2bp被稱為是固有剪切位點，可破壞固有剪切位點，造成外顯子完全不識別，最終導致蛋白異常表達影響蛋白功能，其致病性最強。第9號內含子c.1677-1G＞A是典型的固有剪切突變，影響了mRNA的剪切[12]，該剪切突變位點鮮有報道。本例通過氣相色譜/質譜串聯技術對先證者血液、尿液進行了檢測高度懷疑為MMA，通過測序的方法準確作出MMA分型，位于MUT基因的兩個突變位點 c.1280G＞A（p.Gly427Asp）和 c.1677-1G＞A（p.?）是導致單純型MMA的主要原因，該類型屬對維生素B12治療無反應型，MMA基因型的分子生物學診斷有助于對不同類型MMA患者進行基因分型，準確選擇診療方案；同時有助于進行家系攜帶者檢測和產前診斷分析[13]，為家庭優生優育提供具體可行的方向。分子生物學檢測技術幫助臨床醫生提供精準治療導向，切實對新生兒遺傳代謝病做到早發現、早診斷、早干預、早治療。