川芎嗪對膿毒癥急性腎損傷小鼠血管內皮細胞的保護作用

應靜 吳晉 姚利峰

急性腎損傷（acute kideny injury，AKI）是膿毒癥患者最常見的并發癥。據報道，64.4%的膿毒癥患者發展為AKI[1]，而且膿毒癥致AKI患者病死率顯著增加，是非膿毒癥致AKI及單純膿毒血癥患者的5倍[2-3]，目前尚缺乏有效的治療措施[4]。川芎嗪是從傘形科藁本屬植物川芎的根中提取的生物堿，長期用于治療缺血缺氧性心血管疾病[5]。最近的基礎和臨床研究表明，川芎嗪具有廣泛的藥理作用，如抗氧化應激、抗炎、抗凋亡、保護腎臟、抑制內皮細胞的凋亡等[6-10]。但是川芎嗪對膿毒癥所致AKI的影響，目前尚未見到相關報道。本研究將川芎嗪用于膿毒癥小鼠模型，旨在探討川芎嗪對膿毒癥AKI小鼠血管內皮細胞的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級雄性C57BL/6小鼠54只（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），6～8周齡，體重20～25 g。主要試劑：鹽酸川芎嗪（平光制藥股份有限公司）。蘇木精-伊紅（美國SIGMA公司）。一抗Anti-vWF antibody（Proteintech公司）。二抗HRP標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）。DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。主要儀器：數碼相機（佳能505D）、電子天平（蘇測電子科技有限公司，SC-AC-1200AS型）、超低溫冰箱（青島海爾集團，DW-86L388型）、隔水式恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司，PYX-DHS500BS-Ⅱ型）、輪轉式切片機（LEICA公司，RM2235型）、病理組織漂烘儀（常州市郝思琳儀器設備有限公司，Tec 2500型）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將54只小鼠常規適應性飼養1周后，按照隨機化區組分為5組：假手術組10只，安慰劑組、川芎嗪低劑量組、川芎嗪中劑量組、川芎嗪高劑量組各11只。

1.2.2 膿毒癥模型建立及分組給藥 采用盲腸結扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）手術建立小鼠膿毒癥模型。假手術組：只做剖腹關腹，不行CLP。安慰劑組：先予尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液0.15 ml，預處理30 min后行CLP造模。川芎嗪低、中、高劑量組：根據文獻[11-12]，分別尾靜脈注射不同濃度川芎嗪（10、30、60 mg/kg川芎嗪溶于0.15 ml 0.9%氯化鈉注射液中），預處理30 min后CLP造模。

1.3 觀察指標 觀察5組小鼠造模后6 h、12 h、24 h、3 d存活率。造模后第3天每組存活的小鼠中隨機取5只，用代謝籠采集24 h小鼠尿液，然后4%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，通過摘除眼球放血法處死，并眼眶采血1 ml左右。小鼠放血死亡后立即取出腎臟，以蒸餾水反復沖洗除去血污，光鏡下拍照。留取左側腎臟標本，剪一半用以檢測腎臟含水量，另一半腎臟凍存。右側腎臟4%甲醛固定后送病理檢查。

1.3.1 腎臟含水量檢測 將半個腎臟稱其濕重后，置于37℃烘箱烘48 h后稱干重，以（濕重-干重）/濕重×100%計算腎臟含水量來判定腎臟的水腫程度。

1.3.2 腎組織病理學檢查 將4%甲醛固定的腎臟標本經梯度乙醇脫水、石蠟包埋切片（厚度4 μm），行HE染色，光學顯微鏡下放大200倍觀察腎組織的形態結構以及炎癥情況，并進行半定量評分，腎小管上皮有無凋亡、壞死或絨毛減少（1分），腎小管管腔有無擴張（1分），腎間質有無管型（1分）或炎癥浸潤（1分），腎間質有無充血或腎小球毛細血管瘀血（1分），每有1項加1分，總分為5分，0分代表無明顯病變，評分越高則表示腎損傷程度越重。

1.3.3 腎損傷分子1（kidney injury molecule 1，Kim-1）水平的測定 采用ELISA法。將小鼠尿液樣本以1 000 r/min離心10 min。取離心后的上清液100 μl添加至ELISA板上，在37℃溫育1 h后棄去孔內液體。然后順序加反應試劑A和B，甩干后加底物溶液90 μl，在37℃避光顯色20 min，最后加終止液50 μl。在確保板底無水滴及孔內無氣泡，立即用酶標儀于450 nm波長測量各孔的光密度值（OD值）。

1.3.4 內皮細胞損傷標志物血管性血友病因子（von Willebr and Factor，vWF）表達的檢測 采用免疫組化法。將4%甲醛固定的腎臟標本經梯度乙醇脫水、石蠟包埋切片（厚度 4 μm）。采用一抗 Anti-vWF antibody（稀釋 1∶50，美國Proteintech公司）、二抗HRP標記的山羊抗兔IgG（無稀釋，中杉金橋生物技術有限公司），然后用DAB顯色試劑盒進行比色檢測，在光學顯微鏡下放大200倍觀察并獲得圖像。染色結果采用半定量分析方法：以染色強度結合陽性細胞數百分比進行評分。染色強度以多數細胞呈現的染色強度并減去背景著色計分：無明顯著色為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。陽性細胞百分比即每張免疫組化切片選擇5個不同的視野（×200）觀察：0～5%為 0分，6%～25%為 1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%均為4分。最終分值以陽性細胞百分比與染色強度之和表示，0分為陰性，3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強陽性。

2 結果

2.1 5組小鼠存活率的比較 在CLP術后第3天，安慰劑組小鼠的存活率明顯低于假手術組（表1），第3天存活率僅為45.5%。川芎嗪預處理可提高小鼠存活率，川芎嗪高劑量組小鼠存活率最高（與假手術組相似）。

表1 5組小鼠存活率的比較[只（%）]

2.2 5組小鼠腎臟含水量的比較 安慰劑組小鼠腎臟含水量明顯高于假手術組（P＜0.01）。與安慰劑組相比，經過川芎嗪預處理的小鼠腎臟含水量明顯降低（P＜0.05）。此外，川芎嗪高劑量組小鼠腎臟含水量降低到與假手術組小鼠相似的水平。見表2。

表2 5組小鼠腎臟含水量的比較（%）

2.3 5組小鼠腎臟病理形態學分析 鏡下觀察可見，假手術組無明顯組織學病變，安慰劑組腎組織損傷最嚴重，不同的樣本中可以發現腎小管內管型及擴張，明顯的腎間質炎癥，腎小管上皮水腫、凋亡和間質充血及小球毛細血管淤血（圖1，插頁）。對腎臟的組織學特征進行半定量評分（表3），安慰劑組評分明顯高于假手術組（P＜0.01）。與安慰劑組相比，川芎嗪中劑量組和高劑量組評分明顯降低（均P＜0.05）。

圖1 5組小鼠腎臟組織病理結果（紅色箭頭示蛋白管型，藍色箭頭示間質充血或小球毛細血管淤血，黃色箭頭示腎小管擴張，HE染色，×200）

2.4 5組小鼠尿液Kim-1水平的比較 安慰劑組尿液Kim-1水平較假手術組明顯升高（P＜0.01），與安慰劑組相比，川芎嗪低劑量組尿液Kim-1水平無統計學差異，川芎嗪中劑量和高劑量組尿液Kim-1水平顯著降低（P＜0.05），見表 4。

表3 5組小鼠腎臟病理損傷評分的比較（分）

表4 5組小鼠尿液Kim-1水平的比較（pg/ml）

2.5 5組小鼠vWF表達的比較 鏡下觀察可知，vWF表達于細胞質中，陽性呈黃棕色（圖2，插頁）。安慰劑組vWF表達評分明顯高于假手術組（P＜0.01）。與安慰劑組相比，川芎嗪低、中、高劑量組vWF表達評分明顯降低（P＜0.05），且隨著川芎嗪劑量的增高評分依次降低，高劑量組表達最低，接近假手術組水平，見表5。

圖2 5組小鼠腎臟組織vWF表達的影響（CLP術后3 d，免疫組化檢測小鼠腎組織vWF表達，vWF表達于細胞質中，陽性呈黃棕色）

表5 5組小鼠vWF表達的比較（分）

3 討論

膿毒癥以器官功能障礙為特征，長期以來被推測與AKI的發展有關，膿毒癥合并AKI是危重患者不良預后的獨立危險因素，能夠導致患者病死率顯著增加[4，13]。研究表明，這種病理改變可以通過外科手術（CLP）來實現，CLP常用于膿毒癥實驗的醫學研究[14]。本研究通過CLP手術成功建立了小鼠膿毒癥模型，并產生了嚴重的腎臟損傷。結果顯示，安慰劑組小鼠的存活率明顯低于假手術組，第3天存活率僅為45.5%，假手術組為100%。安慰劑組小鼠腎臟含水量明顯高于假手術組，腎臟水腫嚴重，HE染色下可見安慰劑組小鼠腎組織損傷最嚴重，不同的樣本中可以發現腎小管內管型及擴張，明顯的腎間質炎癥，腎小管上皮水腫、凋亡和間質充血及小球毛細血管瘀血，而假手術組小鼠腎組織無明顯病理改變。在膿毒癥相關的AKI中，Kim-1是一個重要的急性腎臟損傷標志物[15]，尿液Kim-1水平升高可以較早的提示發生了腎小管損傷[16-17]。本研究同樣觀察到安慰劑組小鼠尿液中Kim-1水平較假手術組有明顯增高（P＜0.01）。

目前膿毒癥造成腎臟損傷機制還不完全明了，但多數研究認為與以下因素有關：炎性介質、凝血功能異常、腎缺血再灌注、內毒素、細胞壞死和細胞凋亡。其中血管內皮細胞的激活與損傷扮演了非常重要的角色。研究表明，膿毒癥進展中大量釋放的內毒素既能夠刺激機體炎癥反應的級聯放大激活并通過炎癥反應來引起內皮細胞損害，也能直接作用于血管內皮，啟動細胞凋亡程序引起內皮細胞損傷[18-19]。受損的內皮細胞產生血管擴張因子減少，氧化應激水平明顯提高，血管內壁結構完整性被破壞，腎毛細血管腫脹閉塞、通透性增加，導致腎微循環功能障礙，這可能是膿毒癥所致AKI發生的重要血流動力學因素[20-21]。vWF是體內止血和血栓形成的主要血漿成分，90%以上的血液循環中vWF是由內皮細胞合成釋放的。內皮細胞損傷和功能紊亂后產生vWF增多，導致局部臟器呈現高凝狀態，微血栓形成，加重微循環功能障礙。因此vWF可以作為反映內皮細胞損傷的靈敏生物學指標[22]。本研究中，免疫組化顯示假手術組小鼠腎組織vWF低表達，安慰劑組小鼠vWF表達明顯高于假手術組，也提示膿毒癥小鼠腎組織內皮細胞出現明顯損傷。因此調整腎血管內皮細胞功能可能為膿毒癥相關的AKI患者提供一種潛在的治療選擇。

川芎嗪作為從傳統中草藥川芎中提取的生物堿，被證實對循環系統和血管內皮系統有廣泛的藥理作用，已廣泛應用于冠心病、缺血性腦血管病、血栓閉塞性血管病、肺動脈高壓以及肺心病的治療。很多研究證實川芎嗪具有腎臟保護功能，川芎嗪可以減輕小鼠和大鼠的腎缺血再灌注損傷[23-24]，可以抑制抗癌藥物順鉑誘導的大鼠腎小管凋亡[25]，還被證實可以抑制阿霉素、慶大霉素誘導的大、小鼠腎小管細胞凋亡[26-28]。但是對膿毒癥所致AKI的影響目前尚不清楚。

本研究使用川芎嗪治療CLP手術誘導的膿毒癥AKI小鼠，發現川芎嗪預處理能顯著減輕腎臟損傷，保護腎功能，提高膿毒癥AKI小鼠生存率。與安慰劑組相比，川芎嗪組小鼠生存率顯著提升，川芎嗪高劑量組小鼠3 d存活率達到100%。川芎嗪各劑量組小鼠的腎臟含水量也較安慰劑組明顯降低，提示川芎嗪改善了腎臟的水排泄功能，有助于減輕腎功能障礙。小鼠腎組織HE染色后高倍鏡下觀察可知，假手術組小鼠無明顯腎組織學改變，安慰劑組則發生明顯的腎組織病理損傷。與安慰劑組相比，川芎嗪組，特別是中劑量組和高劑量組小鼠的腎組織學病理損傷評分明顯降低，川芎嗪各劑量組隨著川芎嗪劑量增高腎組織損傷逐漸減輕，這表明川芎嗪對膿毒癥AKI小鼠有積極的治療作用。小鼠尿液Kim-1水平變化也提示了川芎嗪對膿毒癥AKI小鼠腎臟的保護作用，與安慰劑組相比，川芎嗪中劑量和高劑量組尿液Kim-1水平顯著降低。同時發現，vWF表達在安慰劑組小鼠腎組織中顯著升高，而在川芎嗪各劑量組則顯著降低，且隨著川芎嗪預處理劑量的增加依次降低，川芎嗪高劑量組的vWF表達已經降低到接近假手術組的程度，表明川芎嗪能有效減輕膿毒癥AKI小鼠腎血管內皮細胞的損傷。川芎嗪保護血管內皮細胞的機制很廣泛，有研究認為川芎嗪可能是通過保護超氧化物歧化酶和谷光甘肽過氧化物酶活性，增強內皮細胞的抗氧化能力來保護內皮細胞[29]；也有多項細胞實驗證實川芎嗪對氧化應激、缺血缺氧引起的內皮細胞凋亡具有抑制作用[30-31]。這些研究為川芎嗪保護血管內皮細胞提供了理論基礎。

綜上所述，在小鼠的膿毒癥所致AKI中，川芎嗪能有效減輕腎臟損傷，保護腎功能，該作用可能與川芎嗪對血管內皮細胞的保護作用有關，需要進一步研究來尋找川芎嗪保護血管內皮細胞，保護膿毒癥所致AKI的分子機制。