兩株耐鉛鎘菌株的分離篩選及鉛鎘去除性能研究

張 璐，薛林貴*，武雯雯，李明聰，王韶梅，劉映彤，何圓圓

(1. 蘭州交通大學 化學與生物工程學院，蘭州 730070；2. 甘肅省極端環境微生物資源與工程重點實驗室，蘭州 730070)

隨著21世紀工農業的快速發展，重金屬污染問題開始受到廣泛關注[1].采礦、尾礦堆積、礦業廢棄等一系列礦山開采活動形成多種重金屬復合污染[2-4]使得土壤質量下降、微生物多樣性降低、植被覆蓋率也隨之下降[5-6].周邊的農田土壤也會出現重金屬超標的現象[7]，甚至重金屬會隨食物鏈進入人體，影響人體健康[8].而目前，針對礦山土壤修復多采用物理化學修復、微生物或植物微生物聯合修復[9-10],其中微生物和植物微生物聯合修復技術，由于其具有方法簡便、修復成本低、無二次污染等優點被廣泛應用，而篩選出重金屬耐受細菌，是進行生物修復的基礎和關鍵.

為了得到對重金屬耐受力較強的微生物，并且考慮到后期修復應用過程中微生物對尾礦環境的適應性，一般選擇在礦區進行土著微生物的篩選[11].不同種類礦山重金屬污染中，經常伴隨出現鉛鎘復合污染[12-14]，篩選具有鉛鎘“雙耐性”細菌的研究報道較鉛、鎘單一耐性菌的研究少，且耐受濃度都不是很高.付瑾等[15]篩選出的皮氏羅爾斯通氏菌，可耐受1 600 mg·L-1的Cd2+.Naranjargal等[16]從金礦中篩選到了芽孢桿菌Z1，對Pb2+的耐受性達到了800 mg·L-1.Abdollahi等[17]分離并鑒定了5種耐藥菌株,包括陰溝腸桿菌，科氏腸桿菌，蠟狀芽孢桿菌，膿毒根瘤菌和根癌農桿菌，這5種菌可耐受3 500 mg·L-1的鉛和100 mg·L-1的鎘.黃軍等[18]從極度重金屬污染的土壤中篩選得到了大腸桿菌LY29-1-5，該菌株可耐受1 500 mg·L-1的鎘離子，且對鉛也表現出了一定的耐受性.

通過對臨澤硫鐵礦尾礦采集樣本的分析，發現其鉛鎘含量很高，且可培養微生物數量較多.值得對其中的耐受菌資源展開深入發掘.本研究對臨澤硫鐵礦尾礦污染土壤中強耐鎘離子(Cd2+)、鉛離子(Pb2+)的細菌進行分離、篩選和鑒定,并對篩選鑒定的細菌株系的重金屬去除性能進行了初步研究,以期為礦山土壤重金屬污染的微生物修復工程提供種質資源和基礎理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤采樣

篩菌土壤樣本采自甘肅省張掖市臨澤縣的宏鑫礦業尾礦區，采用五點取樣法進行采樣，采樣深度為0～20 cm，采樣尾礦區中心地理位置為東經100°14′49″，北緯39°29′15″，采集的樣品充分混合后盡快帶回實驗室備用.該土壤含鉛鎘的量如表1所列.

表1 采樣土壤含重金屬量

1.1.2 試劑與培養基

溶液的配制：鉛溶液：Pb(NO3)2；鎘溶液：CdCl2.

培養基：牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL)、LB培養基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL).

1.2 研究方法

1.2.1 菌種篩選

將95 mL裝有適量沸石的牛肉膏蛋白胨液體培養基滅菌，稱取5 g土樣加入其中，加入過濾除菌后的Pb(NO3)2、CdCl2溶液，分別使培養體系Pb2+、Cd2+濃度達到200 mg·L-1,50 mg·L-1,30 ℃、150 r·min-1振蕩培養5 d后轉接至新的培養基中，此時Pb2+、Cd2+濃度增長至 400 mg·L-1、100 mg·L-1，相同條件繼續培養，以此類推，轉接第5次后進行平板涂布，劃線分離，選擇長勢較好的菌株保存，進行后續實驗.

1.2.2 菌種鑒定

對篩選出的菌株進行平板劃線分離，初步觀察其菌落形態.對重金屬耐受菌提取總DNA，然后進行PCR擴增，擴增結果提交西安擎科澤西生物技術有限公司進行序列測定.

1.2.3 篩選菌種生物學性能研究

向LB培養基添加 Cd2+儲備液,使培養液中的 Cd2+終濃度分別為0 mg·L-1，100 mg·L-1，200 mg·L-1，300 mg·L-1，400 mg·L-1和500 mg·L-1；將斜面保存的耐Cd2+菌株在LB培養液中活化至OD600 nm=0.8，以2%接種量接入培養液中,每個濃度設置三組平行，30 ℃、150 r·min-1振蕩培養，分別在4 h，8 h，12 h，24 h，48 h取樣，測定600 nm處的OD值，觀察菌株在不同Cd2+濃度下的生長情況.Pb2+終濃度設置為0 mg·L-1、1 000 mg·L-1、2 000 mg·L-1、3 000 mg·L-1、4 000 mg·L-1，重復上述操作.

1.2.4 篩選菌株對液體中鉛鎘去除能力的影響因素研究

菌株生長曲線測定：將菌株G-1、G-2分別培養至對數期(OD600 nm=0.8)，接入已滅菌的LB培養基中，設置三組平行,30 ℃、150 r·min-1恒溫搖床培養，分別于1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h，48 h，72 h，96 h，120 h和144 h取樣，測定OD600 nm的值，繪制生長曲線.

菌株不同生長階段對鉛鎘去除效果測定：將菌株G-1、G-2培養至對數期(OD600 nm=0.8)，分別接入已滅菌的LB培養基中，體系中Pb2+、Cd2+設置為400 mg·L-1、200 mg·L-1,30 ℃、150 r·min-1恒溫搖床培養，于對數期(12 h)、穩定期(48 h)、衰亡期(120 h)分別取樣，離心后測定上清液中Pb2+、Cd2+的濃度，計算不同生長階段兩菌株對液體培養基中鉛鎘的去除率.

菌株去除溶液中Pb2+、Cd2+的最適條件探究：最適溫度實驗：將馴化后的菌株接入已滅菌的LB培養基中，Pb2+、Cd2+濃度分別為200 mg·L-1、400 mg·L-1，接種量保持為1%，溫度梯度設置為25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃，設置三組平行，150 r·min-1培養48 h后，離心取上清液測量Pb2+、Cd2+殘余，計算重金屬去除率.最適pH實驗：在最適溫度條件下，Pb2+、Cd2+濃度分別為200 mg·L-1、400 mg·L-1，接種量保持為1%，pH梯度設置為5、6、7、8、9，設置三組平行，30 ℃、150 r·min-1培養48 h后，離心取上清液測量Pb2+、Cd2+殘余，計算重金屬去除率.耐鹽性實驗:將馴化后的菌株接入已滅菌的LB培養基中(pH=8)，鉛鎘濃度為200 mg·L-1、400 mg·L-1，NaCl濃度梯度為1%、2%、3%、4%、5%，設置三組平行，30 ℃、150 r·min-1培養48 h后離心取上清測量Pb2+、Cd2+殘余，計算重金屬去除率.最佳接種量實驗：將馴化后的菌株接入已滅菌的LB培養基中(pH=8、NaCl %=3)，鉛鎘濃度分別為200 mg·L-1、400 mg·L-1，接種量為1%、2%、3%、4%、5%，設置三組平行，30 ℃、150 r·min-1培養48 h后，離心取上清測量Pb2+、Cd2+殘余，計算重金屬去除率.

1.2.5 鉛鎘量的測定

鉛鎘量采用ICP-MS測定，采用公式(1)計算重金屬去除率

(1)

其中：η為去除率；Co表示處理前溶液中重金屬濃度；Ce表示處理后溶液中重金屬濃度.

1.2.6 數據分析

將兩株菌經16S rRNA基因測序后所得序列與NCBI數據庫中已有的序列進行BLAST比對分析，通過MEGA 5.0軟件制作系統發育樹.其余數據用Origin 8.5和SPASS 19.0進行分析.

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

經過對土壤樣品的富集培養，以平板涂布和劃線分離法進行分離純化，初步篩選出7株重金屬耐受菌株，分別編號為G-1、G-2、G-3、G-4、G-5、G-6、G-7，再經過復篩馴化培養后，在不同鉛鎘離子濃度下的生長情況如表2所列.由表2可以看出，在鉛鎘離子濃度分別為2 000 mg·L-1、200 mg·L-1時，7株菌株均可生長，但隨著鉛鎘離子濃度的增加，G-1可在鉛鎘離子濃度分別為2 000 mg·L-1、200 mg·L-1的培養基中生長，G-2可在鉛鎘離子濃度分別為2 000 mg·L-1、200 mg·L-1的培養基中生長，兩株菌株均表現出了較高的耐受性，其他菌則停止生長.研究結果表明，G-1、G-2為具有較強鉛鎘耐受能力的優勢菌株.

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態特征

培養溫度為30 ℃，在含有鉛鎘離子濃度分別為200 mg·L-1、50 mg·L-1的LB培養基上培養24 h后進行革蘭氏染色，耐鉛鎘菌株G-1、G-2的菌落形態如圖1所示.G-1菌落表面呈白色，不規則圓形，邊緣不齊整，有毛絨狀突起，表面較干燥，質地均勻.G-2菌落表面呈淡黃色，形狀規則，呈圓形，小而均勻，表面較濕潤.革蘭氏染色鑒定結果顯示菌株G-1、G-2均為革蘭氏陰性菌.

2.2.2 16S rRNA分子鑒定

利用PCR擴增16S rRNA基因，對擴增后的序列進行拼接，利用BLAST進行比對，通過MEGA 5.0構建系統發育樹，結果見圖2.結果顯示，G-1與已知分類地位的標準菌株Bacilluswiedmanniistrain ER6(MT124531.1)親緣關系很近，16S rRNA序列一致性為100%,G-2則與標準菌株Klebsiellapneumoniaestrain 285(GU451217.1)親緣關系很近，16S rRNA序列一致性為99.86%.因此，G-1菌株被鑒定為Bacilluswiedmannii，G-2菌株被鑒定為Klebsiellapneumoniae.

表2 菌株在不同鉛鎘離子濃度下的生長情況

2.3 重金屬耐受菌株生物學性能研究

菌株G-1、G-2在不同鎘離子濃度下的生長情況分別如圖3所示，兩株菌對鎘離子的耐受濃度都達到了500 mg·L-1，隨著隔離子濃度的升高，兩株菌的生長開始逐漸受到抑制，在400 mg·L-1的濃度下，G-1、G-2都能較好的生長，濃度達到500 mg·L-1時，其生長明顯受到抑制，此時G-1的生長情況略好于G-2,說明G-1對鎘的耐受性高于G-2.兩株菌在不同鉛離子濃度下的生長情況分別如圖4所示，兩株菌對鎘離子的耐受濃度均達到了4 000 mg·L-1，隨著鉛離子濃度的升高，兩株菌的生長開始逐漸受到抑制，在4 000 mg·L-1的濃度下，G-1、G-2都能較好的生長，抑制作用不太明顯，此時G-2的生長情況略好于G-1,說明G-2對鉛的耐受性高于G-1.

圖4 菌株在不同Pb2+濃度下的生長情況Fig.4 The growth of strains at different Pb2+ concentrations

2.4 菌株對液體中鉛鎘去除能力的影響因素研究

2.4.1 菌株G-1、G-2的生長曲線及其不同生長階段對Pb2+、Cd2+的去除能力

菌株G-1、G-2的生長曲線及其不同生長階段對Pb2+、Cd2+的去除能力如圖5所示.根據圖5(a)可知菌株G-1和G-2在LB培養基中生長，延滯期均不明顯，0～20 h期間經歷了對數期，生長迅速，20 h之后均進入穩定期，菌株G-1在120 h時進入衰亡期，G-2則在80 h時較G-1提早進入衰亡期.菌株在不同生長階段對液體中的Pb2+、Cd2+的去除效果如圖5(b)所示，兩株菌在48 h時對液體中Pb2+、Cd2+的去除率最高，菌株G-1對Cd2+去除率為81.97%，高于G-2,菌株G-2則對Pb2+顯示出更好的去除效果，去除率達到了98.96%，此時菌株正處于穩定期.因此，依據圖5研究結果，培養48 h的菌懸液用于水體和土壤的重金屬污染修復處理能夠獲得很好的修復效果.

2.4.2 溫度對菌株Pb2+、Cd2+去除效果的影響

菌株G-1與G-2在不同溫度下對鉛鎘離子的去除率如圖6所示，由圖6(a)可以看出，G-1菌株在不同溫度下對Cd2+的去除率都大于等于57%，在32 ℃時，對Cd2+的去除率最高，達到了71.34%，對Pb2+的去除率均大于等于63%，在32 ℃時則達到了最高89.22%.由圖6(b)可以看出G-2菌株在不同溫度下對Cd2+的去除率都大于等于49%，在32 ℃時，對Cd2+的去除率最高，達到了62.19%，對Pb2+的去除率均大于等于80%，在30 ℃時達到了93.21%.對比G-1、G-2在32 ℃時對Pb2+、Cd2+的去除率可以看出，G-1對鎘離子的去除能力強于G-2，G-2對Pb2+的去除率則明顯高于G-1.且相較于Pb2+去除效果，兩株菌去除Cd2+的效果受溫度的影響稍大一點.

圖5 菌株生長曲線和不同生長階段菌株對Pb2+、Cd2+的去除率Fig.5 Growth curve of the strains and the removal rate of lead and cadmium by strains at different growth stages

圖6 溫度對菌株去除Pb2+、Cd2+的影響Fig.6 Effect of temperature on the removal of Pb2+ and Cd2+ by strains

2.4.3 pH值對菌株Pb2+、Cd2+去除效果的影響

菌株G-1與G-2在不同pH下對鉛鎘離子的去除率如圖7所示，由圖7(a)可以看出，G-1菌株在不同pH下對Cd2+的去除率均大于等于60%,G-1菌株對Cd2+的去除率在pH值為5～8時隨pH的增加而增加，在pH等于8時最高，達到了76.94%.pH大于7時菌株對Cd2+的去除率則有所下降，推測可能是因為pH大于7 時，菌株的生長受到一定的抑制，從而影響了去除效果.G-1對Pb2+的去除率也是隨pH的增加先增加，在pH等于7時達到了最大，隨著pH的進一步增大，Pb2+去除率也有所下降.在中性偏酸性條件下菌株G-1的Pb2+、Cd2+去除率高于偏堿性條件下的去除率，由圖7(b)可以看出G-2菌株對Cd2+、Pb2+的去除率在pH等于5時均最低，隨著pH值的增加而增加，均在pH等于8時達到了最大，分別是63.93%、99.34%，隨后隨著pH的繼續增加開始出現下降的趨勢.相較于Pb2+去除效果，菌株G-2對Cd2+的去除效果隨pH的變化呈現了更為明顯的變化.

2.4.4 鹽濃度對菌株Pb2+、Cd2+去除效果的影響

菌株G-1與G-2在不同鹽濃度下對鉛鎘離子的去除率如圖8所示，由圖8(a)可以看出，菌株G-1在不同NaCl濃度下對鉛鎘離子均具有一定的去除效果,G-1菌株對鎘離子的去除率隨著NaCl濃度的增加而增加，在NaCl濃度達到3%時最高，達到了78.89%.隨著NaCl濃度的繼續升高，菌株對鎘離子的去除率開始出現明顯下降.相較于鎘離子，G-1菌株對鉛離子的去除效果受NaCl濃度變化影響較小，也是在NaCl濃度為3%時達到最高，去除率為91.96%，隨著NaCl濃度的進一步增大，鉛去除率也有所下降.由圖8(b)可以看出G-2菌株對鉛鎘離子的去除率在NaCl濃度達到3%時均達到最高，分別為65.20%、98.35%.在不同NaCl濃度下，菌株G-2對鉛鎘離子的去除率變化均不超過5%，且在NaCl濃度為3%時均達到最高，鹽濃度的變化對其鉛離子去除效果的影響并不顯著，說明菌株具有一定的耐鹽能力.

圖7 pH對菌株去除Pb2+、Cd2+的影響Fig.7 Effect of pH on the removal of Pb2+ and Cd2+ by strains

圖8 鹽濃度對菌株去除Pb2+、Cd2+的影響Fig.8 Effect of the NaCl concentration on the removal of Pb2+ and Cd2+ by strains

2.4.5 接種量對菌株Pb2+、Cd2+去除效果的影響

菌株G-1與G-2在不同接種量下對鉛鎘離子的去除率如圖9所示，由圖9(a)可以看出，菌株G-1在不同接種量下對鉛鎘離子均具有一定的去除效果,G-1菌株對鎘離子的去除率先是隨著接種量的增加而增加，在接種量等于2%時達到了80.66%.隨著接種量的繼續升高，去除率則開始下降，可能是因為接種量過大，細胞消耗營養快且多，生長后勁不足.菌株G-2對鉛離子的去除率均達到了80%以上，在接種量2%時去除效果最好，去除率達到了91.32%.由圖9(b)可以看出相較于鎘離子，G-2菌株對鉛離子的去除效果受接種量變化影響較小，G-2菌對鉛離子的去除率均高于96%，呈現出了較高的鉛離子去除效果，在接種量為2%時，對鉛離子的去除率高達99.44%.

圖9 接種量對菌株去除Pb2+、Cd2+的影響Fig.9 Effect of the inoculation amount on the removal of Pb2+ and Cd2+ by strains

3 結論

本研究從重金屬污染的鐵礦尾礦土壤中分離篩選到了7株細菌，可分別耐受2 000 mg·L-1、200 mg·L-1的鉛鎘，通過進一步的馴化后菌株G-1、G-2顯示出更高的耐受性，能在鉛、鎘離子濃度分別為4 000 mg·L-1、400 mg·L-1的條件下較好的生長，菌株G-1能分別在4 000 mg·L-1、500 mg·L-1的鉛鎘離子濃度下緩慢生長.經分子生物學鑒定，G-1為芽孢桿菌屬 (Bacillussp.),G-2為克雷伯菌(Klebsiellasp.).菌株G-1在pH為7、32 ℃、NaCl濃度4%、接種量為2%的情況下，對液體中鉛鎘的去除率達到最大，分別為91.32%、80.66%.菌株G-2則在pH為8、30 ℃、NaCl濃度4%、接種量為2%的情況下，對液體中鉛鎘的去除率達到最大，分別是99.44%、72.89%，且菌株G-1的鎘離子去除效果強于G-2,而G-2則對鉛的去除效果強于G-1.