溫度和藥劑脅迫下黃翅絹野螟實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因篩選

孟倩倩 孫世偉 王政 高圣風(fēng) 茍亞峰 劉愛勤

摘? 要：為篩選黃翅絹野螟（Diaphania caesalis）逆境脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，使該蟲抗逆基因的定量表達(dá)分析標(biāo)準(zhǔn)化。本研究根據(jù)黃翅絹野螟成蟲轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果，利用qPCR技術(shù)分析了9個(gè)分別編碼ACT、β-TUB、GAPDH、G6PDH、RPS3a、RPL13a、EF1α、EIF4A、β-ACT的候選內(nèi)參基因在溫度及藥劑脅迫下mRNA的表達(dá)水平，并通過geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder軟件（算法）分析各基因的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：溫度脅迫下，geNorm分析表明ACT和RPS3a為表達(dá)最穩(wěn)定的基因，NormFinder和BestKeeper分析結(jié)果表明GAPDH和EIF4a的表達(dá)最穩(wěn)定。藥劑脅迫下，geNorm和NormFinder分析結(jié)果均表明EIF4a和ACT為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而BestKeeper分析結(jié)果表明GAPDH和RPS3a為最穩(wěn)定內(nèi)參基因。全樣品條件下，geNorm和NormFinder分析結(jié)果相似，表明EF1α和EIF4a為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，BestKeeper表明GAPDH和RPL13a為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。根據(jù)geNorm軟件成對(duì)變異值Vn/Vn+1<0.15的原則，確定3種條件下對(duì)靶標(biāo)基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)需引入的內(nèi)參基因的數(shù)目均為2個(gè)。利用在線分析軟件RefFinder綜合評(píng)價(jià)上述3個(gè)分析結(jié)果，最終確定溫度脅迫下最合適的內(nèi)參基因?yàn)镋IF4A和GAPDH，藥劑脅迫下最適內(nèi)參基因?yàn)锳CT和EIF4A，全樣品下最適內(nèi)參基因?yàn)镋F1α和EIF4A。本研究結(jié)果為利用qPCR技術(shù)分析黃翅絹野螟溫敏及抗藥性相關(guān)基因表達(dá)差異提供了穩(wěn)定的內(nèi)參基因，進(jìn)而為基因的功能分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃翅絹野螟;溫度脅迫;藥劑脅迫;內(nèi)參基因;穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：S433.4? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to normalize the expression of stress resistant genes， this study aims to select the reference genes stably expressed of Diaphania caesalis under different stress conditions. According to the annotation information of the transcriptome of D. caesalis， the mRNA expression levels of nine candidate genes predicted to code proteins of ACT， β-TUB， GAPDH， G6PDH， RPS3a， RPL13a， eEF1α， EIF4A and β-ACT， were analyzed by qPCR under temperature and pesticide stress. The stability of each gene was evaluated by geNorm， NormFinder， BestKeeper and RefFinder softwares （algorithms）， respectively. In temperature stress， the most stable genes identified by geNorm were ACT and RPS3a. However， NormFinder and BestKeeper recommended that GAPDH and EIF4a were the most stable genes. In pesticide stress， EIF4a and ACT were ranked as the most stable genes by geNorm and NormFinder， but GAPDH and RPS3a were recognized as the most suitable reference genes referred from the analysis with software of BestKeeper. In all samples， the results analyzed by the softwares of geNorm and NormFinder were similar， which both found that the ideal internal control were EF1α and EIF4a. But GAPDH and RPL13a were considered as the most stable genes based on the result of BestKeeper. Complying with the principle of Vn/Vn+1<0.15 from geNorm software， the two internal reference genes should be introduced in the three treatments above for normalization of target gene expression， respectively. The online software of RefFinder was used to comprehensively evaluate the results of the three softwares. Finally， the most suitable reference genes in temperature stress were confirmed as EIF4A and GAPDH. ACT and EIF4A were determined as the most stable reference genes in pesticide stress， and EF1α and EIF4A were recommended as the most suitable reference genes in all samples. This study would provide suitable internal reference genes for qPCR analysis of the expression of target genes associated to temperature sensitivity and insecticide resistance. Furthermore， it could also lay the foundation for gene functional analysis.

Keywords： Diaphania caesalis; temperature stress; pesticide stress; reference gene; stability

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.026

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qPCR）因其靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)和快速準(zhǔn)確等技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因的特異性擴(kuò)增、mRNA表達(dá)水平分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和單核苷酸多態(tài)性分析等研究領(lǐng)域[1]。然而，qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性易受生物信號(hào)、引物擴(kuò)增效率，模板的產(chǎn)量和質(zhì)量等因素影響[2-5]，需要引入穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)Χ拷Y(jié)果進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化處理，以減小實(shí)驗(yàn)誤差，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[6]。因此，選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因是進(jìn)行qPCR過程中至關(guān)重要的一步。一般認(rèn)為，理想化的內(nèi)參基因應(yīng)是維持細(xì)胞正常生命代謝的管家基因，它們?cè)谏锖头巧飾l件下都能相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)[7-9]。傳統(tǒng)的管家基因包括18S核糖體RNA基因（18S rRNA）、微管蛋白基因（tu bulin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase）和肌動(dòng)蛋白基因（actin）等，它們常被作為內(nèi)參基因用于許多物種不同處理?xiàng)l件下基因的表達(dá)分析[10-12]。但越來越多的研究表明，并沒有絕對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因能在不同物種、不同組織及不同實(shí)驗(yàn)條件下均穩(wěn)定表達(dá)，它們只能在特定物種或?qū)嶒?yàn)條件下相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)[13-16]。因此，在利用qPCR對(duì)某物種基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析前，需對(duì)候選內(nèi)參基因在特定條件下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，以選擇最適內(nèi)參基因。

黃翅絹野螟（Diaphania caesalis）屬鱗翅目（Lepidoptera），螟蛾科（Pyralidae），絹野螟屬（Diaphania）。主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布在海南、云南、廣西、廣東等?。▍^(qū)）。該蟲以幼蟲鉆蛀取食菠蘿蜜（Artocarpus heteroyllus Lam.）、榴蓮蜜（Artocarpus champeden Spreng.）和面包果（Artocarpus altilis Fosberg.）等富含淀粉的“木本糧食作物”[17-19]。蛀蟲果易引起果蠅幼蟲進(jìn)入取食，使果實(shí)受害部位變褐腐爛，導(dǎo)致果實(shí)發(fā)育不良、脫落，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30%～50%。該蟲在海南全年都有發(fā)生，且無明顯越冬現(xiàn)象，一年發(fā)生約8代，7—9月為發(fā)生高峰期[20-22]。目前關(guān)于黃翅絹野螟的研究主要包括其發(fā)生為害特點(diǎn)、分布情況及天敵種類等[19， 23-24]。尚無黃翅絹野螟qPCR內(nèi)參基因的篩選研究。隨著研究的深入，基因表達(dá)水平對(duì)于研究黃翅絹野螟的寄主選擇、適應(yīng)性、抗藥性和神經(jīng)調(diào)節(jié)等相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理方面具有重要作用。因此，在分析黃翅絹野螟基因表達(dá)水平之前，首先需評(píng)估不同處理?xiàng)l件下內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。本研究擬檢測(cè)黃翅絹野螟9個(gè)候選內(nèi)參基因在不同溫度和藥劑脅迫下mRNA的表達(dá)水平，并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4個(gè)軟件（算法）分析溫度脅迫、藥劑脅迫和全樣品條件下各候選基因的穩(wěn)定性，篩選出不同處理情況下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以期為黃翅絹野螟溫度和藥劑脅迫下基因表達(dá)水平的研究提供合適的內(nèi)參基因。

1? 材料與方法

1.1? 供試?yán)ハx

黃翅絹野螟采自海南省瓊中縣菠蘿蜜種植園（19°3′24″N， 109°50′58″E），室內(nèi)飼養(yǎng)2代后作為供試?yán)ハx。幼蟲食料為未施農(nóng)藥的菠蘿蜜葉片，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所試驗(yàn)基地（18°44′29″N， 110°12′11″E）。將采集的幼蟲置于保鮮盒中飼喂，待羽化為成蟲后轉(zhuǎn)入網(wǎng)籠，喂食10%的蜂蜜水。向籠中放置菠蘿蜜葉片或鮮果收集卵粒，待孵化后挑出幼蟲至干凈的保鮮盒內(nèi)，放入新鮮菠蘿蜜葉片進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期14 L∶10 D。

1.2? 溫度處理

設(shè)置低溫處理4 ℃、高溫處理37 ℃、超高溫處理42 ℃及對(duì)照處理26 ℃。分別將黃翅絹野螟2～3日齡成蟲置于上述處理下刺激4 h，室溫26 ℃恢復(fù)30 min，每個(gè)處理3頭成蟲，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于液氮?80 ℃下凍存，供提取總RNA。

1.3? 藥劑處理

根據(jù)黃翅絹野螟防治常用藥劑，設(shè)置高效氯氟氰菊酯（lambda-cyhalothrin）進(jìn)行藥劑處理。采用藥膜法處理黃翅絹野螟成蟲，具體方法如下：將2.5%高效氯氟氰菊酯水乳劑（安徽省陰山藥業(yè)有限公司）用丙酮依次稀釋40 000、60 000和80 000，吸取5 mL稀釋好的藥液滴入三角瓶中，迅速順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)三角瓶，確保藥劑均勻形成藥膜，待丙酮揮發(fā)后放入6頭2～3日齡成蟲處理4 h，每個(gè)處理重復(fù)3次，對(duì)照組為未經(jīng)藥劑處理的黃翅絹野螟成蟲，將對(duì)照和處理樣本置于液氮?80 ℃下凍存，供總RNA提取。

1.4? 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采用TRIzol Reagent試劑（Invitrogen公司，美國）分別進(jìn)行上述各處理黃翅絹野螟總RNA的提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用Biotek H1熒光酶標(biāo)儀（Biotek公司，美國）測(cè)定總RNA的濃度和純度，記錄OD260/OD280波長(zhǎng)處的吸光度，比值在1.8～2.2之間的樣品用于cDNA合成。每個(gè)樣品取2 μg RNA，按照FastKing RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]步驟合成cDNA第一鏈，稀釋5倍于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5? 候選內(nèi)參基因的確定及引物設(shè)計(jì)

基于黃翅絹野螟轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果，選擇以下9個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因。經(jīng)NCBI比對(duì)后，分別為編碼肌動(dòng)蛋白基因（Actin， ACT）、β-微管蛋白基因（β-tubulin， β-TUB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（glucose 6 phosphate dehydrogenase， G6PDH）、核糖體蛋白S3a基因（ribosomal protein S3a， RPS3a）、核糖體蛋白L13a基因（ribosomal protein L13a， RPL13a）、延伸因子1α（elongation factor 1 alpha， EF1α）、真核生物啟動(dòng)因子4A（eukaryotic initiation factor 4A， EIF4A）和β-肌動(dòng)蛋白基因（β-Actin， β-ACT）。根據(jù)基因序列信息，利用NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)qPCR引物，基因及引物信息見表1。

1.6? 候選內(nèi)參基因引物特異性及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以1.2中對(duì)照處理RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過qPCR檢測(cè)各基因的mRNA表達(dá)水平，qPCR反應(yīng)使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II（TaKaRa，日本）酶，擴(kuò)增結(jié)束后在60～95 ℃通過熔解曲線分析，檢測(cè)各引物的擴(kuò)增特異性。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制使用5 U/mL Pfu Taq DNA聚合酶（TaKaRa，日本）對(duì)9個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物膠收后分別連接于pMD19-T載體（TaKaRa，日本）于16 ℃過夜，后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α（TaKaRa，日本）中，通過在LB液體培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA抽提采用EZNA Plasmid Mini Kit試劑盒（Omega公司，美國），后依次稀釋5個(gè)梯度，每個(gè)梯度稀釋10倍，以各濃度梯度質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行qPCR。根據(jù)qPCR檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性相關(guān)系數(shù)（R2）和斜率（slope），并計(jì)算引物的擴(kuò)增效率（E），E=（10[-1/slope]-1）×100%，qPCR和PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件、連接、轉(zhuǎn)化等步驟具體參照王政等[7]的方法。

1.7? 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

分別以1.4中合成的cDNA為模板，利用qPCR分析9個(gè)候選內(nèi)參基因在不同處理下的mRNA表達(dá)量，反應(yīng)體系為20 ?L，反應(yīng)條件同1.6。采用geNorm[25]、NormFinder[26]、BestKeeper[27]和RefFinder[28]軟件對(duì)候選內(nèi)參基因在溫度脅迫、藥劑脅迫以及2種處理?xiàng)l件下全樣品的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。geNorm軟件通過計(jì)算平均變異度（mean variability， M）和配對(duì)變異值（pairwise variation， V）來確定最佳的內(nèi)參基因及數(shù)目。geNorm軟件要求M<1.50的基因?yàn)榭捎脙?nèi)參基因，M值越小，候選基因越穩(wěn)定;最佳內(nèi)參基因的數(shù)目要求Vn/Vn+1<0.15，表明最佳內(nèi)參基因數(shù)目為n個(gè)。NormFinder根據(jù)各基因表達(dá)穩(wěn)定值（stability value， SV），SV越小表明基因表達(dá)越穩(wěn)定。BestKeeper軟件計(jì)算每個(gè)基因產(chǎn)生配對(duì)的相關(guān)系數(shù)（r）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation， SD）和變異系數(shù)（coefficient of variation， CV），根據(jù)SD和CV越小則基因越穩(wěn)定的原則，最終對(duì)各基因進(jìn)行排名，SD<1的基因被視為表達(dá)水平較為穩(wěn)定。最后，根據(jù)geNorm軟件Vn/Vn+1推薦的穩(wěn)定內(nèi)參的數(shù)量，利用RefFinder在線分析程序（https：//www.heartcure.com.au/reffinder/？type=reference）對(duì)上述4種方法的分析結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，最終確定各處理?xiàng)l件下適用的內(nèi)參基因。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 候選內(nèi)參基因引物特異性和擴(kuò)增效率檢測(cè)

根據(jù)qPCR結(jié)果，9個(gè)候選內(nèi)參基因的溶解曲線均為單一峰（圖1），PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后條帶單一且明亮，長(zhǎng)度與引物設(shè)計(jì)預(yù)期長(zhǎng)度一致（圖2），無非特異性擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序與黃翅絹野螟轉(zhuǎn)錄組序列一致。表明各基因序列正確，引物特異性良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。以各基因質(zhì)粒DNA進(jìn)行梯度稀釋為模板進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，結(jié)果顯示9個(gè)候選基因的線性相關(guān)系數(shù)R2均在0.998以上，表明模板DNA濃度與相應(yīng)的Ct值線性關(guān)系明確，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可信。各基因的引物擴(kuò)增效率為95.10%～107.5%（表1），表明各基因引物設(shè)計(jì)合理，使用該引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增是有效的。

2.2? 不同樣品中候選內(nèi)參基因mRNA表達(dá)水平分析

qPCR檢測(cè)9個(gè)候選內(nèi)參基因在7個(gè)處理（3個(gè)溫度處理，3個(gè)藥劑處理，1個(gè)對(duì)照組）中的mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，各基因在不同樣品中表達(dá)量均有差異，溫度脅迫條件下平均Ct值范圍為18.23（EF1α）～25.45（β-ACT），表達(dá)量由高到低依次為EF1α（17.19～19.49）>RPL13a（17.58～20.72）>GAPDH（18.49～19.95）>RPS3a（18.19～21.04）>EIF4A（19.52～22.04）>ACT（20.5～23.37）>β-TUB（20.92～24.48）>G6PDH（21.13～24.78）>β-ACT（21.94～27.47）（圖3A）;藥劑脅迫條件下平均Ct值范圍為18.12（EF1α）～ 25.26（β-ACT），表達(dá)量由高到低依次為EF1α（16.90～19.87）>RPL13a（17.58～20.28）>RPS3a（18.11～20.51）>GAPDH（18.49～20.58）>EIF4A（18.66～21.84）>ACT（19.75～22.18）>β-TUB（20.55～24.48）>G6PDH（21.52～25.64）>β-ACT（22.24～27.47）（圖3B）;全樣品條件下平均Ct值范圍為18.22（EF1α）～25.20（β-ACT），表達(dá)量由高到低依次為EF1α（16.90～19.87）>RPL13a（17.58～20.72）>GAPDH（18.49～20.58）>RPS3a（18.11～21.04）>EIF4A（18.66～22.04）>ACT（19.75～23.37）>β-TUB（20.55～24.48）>G6PDH（21.13～25.64）>β-ACT（20.55～27.47）（圖3C）。不同處理?xiàng)l件下，各基因在組間的表達(dá)量差異較大，其中GAPDH的表達(dá)量組間差異最小，β-ACT的表達(dá)量組間差異最大。

2.3? 溫度脅迫下內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

溫度脅迫下，geNorm軟件分析結(jié)果表明，9個(gè)候選內(nèi)參基因平均變異度M值均小于1.5，表明候選內(nèi)參基因在溫度脅迫條件下均可作為內(nèi)參基因使用，其中ACT和RPS3a的M值（0.115）最小，是排名最穩(wěn)定的內(nèi)參基因;β-ACT的M值（0.983）最大，為相對(duì)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因;基因穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1α（0.303）>EIF4A（0.368）> RPL13a（0.508）>G6PDH（0.576）>GAPDH （0.667）>β-TUB（0.861）（圖4A）。NormFinder軟件分析結(jié)果顯示SV值最小的基因?yàn)镋IF4A（0.193），因此EIF4A被推薦為表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，基因穩(wěn)定性排序依次為GAPDH（0.354）> EF1α（0.371）>RPL13a（0.618）>G6PDH（0.636）>ACT（0.716）>RPS3a（0.819）>β-TUB（1.211）>β-ACT（1.292）（圖4B）;BestKeeper軟件分析結(jié)果表明，9個(gè)基因SD值均小于1，因此都可作為內(nèi)參基因使用，其中GAPDH的SD值（0.198）最小;基因穩(wěn)定性排序?yàn)镚APDH（0.198）>EIF4A（0.398）>EF1α（0.451）>ACT（0.605）>RPL13a（0.639）>RPS3a（0.639）>G6PDH（0.676）>β-TUB（0.754）>β-ACT（0.825）（圖4C）。

2.4? 藥劑脅迫下內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

geNorm軟件計(jì)算結(jié)果表明，9個(gè)基因的M值均小于1.5，均可作為藥劑脅迫下基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因。其中EIF4A和ACT的M值（0.087）最小，表達(dá)最穩(wěn)定，基因穩(wěn)定性排序依次為EF1α（0.117）>RPS3a（0.286）>GAPDH（0.332）> RPL13a（0.350）>G6PDH（0.541）>β-TUB（0.728）>β-ACT（0.913）（圖5A）;NormFinder軟件分析9個(gè)基因穩(wěn)定性排序與geNorm結(jié)果一致（圖5B）;BestKeeper軟件分析結(jié)果與geNorm和Norm Finder分析結(jié)果差異較大，其中β-ACT和G6PDH的SD值均大于1，因此其穩(wěn)定性預(yù)測(cè)結(jié)果不可靠，9個(gè)基因穩(wěn)定性排序依次為GAPDH（0.285）>RPS3a（0.387）>EIF4A（0.486）>ACT（0.489）>RPL13a（0.519）>EF1α（0.538）>β-TUB（0.798）>G6PDH（1.266）>β-ACT（1.396）（圖5C）。

2.5? 全樣品條件下內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

全樣品條件下，geNorm軟件分析9個(gè)基因M值均小于1.5，表明所有基因都可用作全樣品條件下的內(nèi)參，基因穩(wěn)定性排序依次為EF1α/EIF4A（0.283）>ACT（0.332）>RPS3a（0.386）>RPL13a（0.477）>GAPDH（0.558）>G6PDH（0.700）>β-TUB（0.824）>β-ACT（0.953）（圖6A）;NormFinder分析結(jié)果表明，最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為EF1α（SV值為0.187）和β-ACT（SV值為1.265），基因穩(wěn)定性排序依次為EIF4A（0.193）>RPL13a（0.461）>ACT（0.545）>GAPDH（0.547）>RPS3a（0.675）>G6PDH（0.951）>β-TUB（1.039）（圖6B）;BestKeeper分析結(jié)果表明，GAPDH的SD值（0.288）和CV值（1.501）均為最小，為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，而β-ACT和G6PDH的SD值均大于1，不能將其作為內(nèi)參基因使用，其余基因穩(wěn)定性排序依次為EIF4A（0.496）>EF1α（0.520）>RPL13a（0.571）>RPS3a（0.592）>ACT（0.602）>β-TUB（0.692）（圖6C）。

2.6? 黃翅絹野螟不同條件下最佳內(nèi)參基因的確定

內(nèi)參數(shù)目可參照geNorm軟件成對(duì)變異值Vn/Vn+1來確定。即當(dāng)Vn/Vn+1<0.15時(shí)，則該條件下最佳內(nèi)參基因的數(shù)目為n個(gè)。geNorm軟件結(jié)果表明，上述不同處理下成對(duì)變異值V2/V3均小于0.15（圖7），因此，研究溫度脅迫、藥劑脅迫和全樣品條件下基因表達(dá)分析時(shí)，需引入2個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。RefFinder綜合geNorm、NormFinder、BestKeeper 3個(gè)軟件的基因穩(wěn)定性排序結(jié)果，最終確定各基因在不同處理?xiàng)l件下的幾何平均值，幾何平均值越小，穩(wěn)定性越好。因此，溫度脅迫下，最終確定的內(nèi)參基因?yàn)镋IF4A、GAPDH;藥劑脅迫下，最終確定的內(nèi)參基因?yàn)锳CT、EIF4A;全樣品下，最終確定的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α、EIF4A（表2）。在進(jìn)行各條件下基因表達(dá)分析時(shí)，可引入上述基因作為內(nèi)參基因。

3? 討論

黃翅絹野螟因其鉆蛀為害寄主植物的特性，化學(xué)防治效果欠佳且生態(tài)弊端顯著，利用分子生物學(xué)手段揭示黃翅絹野螟的生理及行為學(xué)機(jī)制，有助于開發(fā)防控新技術(shù)。qPCR技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域研究基因功能、揭示生理機(jī)制的重要技術(shù)手段，通常采用相對(duì)定量的方法對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，即引入內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)校正目的基因的表達(dá)量[7， 29]。目前，尚無某個(gè)理想的內(nèi)參基因在不同物種和不同處理?xiàng)l件下均能穩(wěn)定表達(dá)。因此，對(duì)某一物種進(jìn)行基因表達(dá)分析前，篩選出在特定實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因至關(guān)重要[30， 13]。黃翅絹野螟是菠蘿蜜、面包果和尖蜜拉等富含淀粉的熱帶果樹上重要的鉆蛀性害蟲，國內(nèi)外未見其內(nèi)參基因篩選的報(bào)道。因此，本研究根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出9個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析。在進(jìn)行基因表達(dá)分析前，首先對(duì)其引物特異性及擴(kuò)增效率進(jìn)行評(píng)估。一般認(rèn)為引物特異性高且擴(kuò)增效率介于90%～110%之間時(shí)，可用于qPCR試驗(yàn)的開展[31]，本研究中9個(gè)候選基因引物均無非特異性擴(kuò)增，且各基因的引物擴(kuò)增效率介于95.10%～107.5%之間，表明各基因引物設(shè)計(jì)合理，符合qPCR擴(kuò)增要求，檢測(cè)結(jié)果有效。

本研究分別采用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對(duì)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基因穩(wěn)定性排序在3種軟件之間存在差異。溫度脅迫下，NormFinder和BestKeeper分析結(jié)果較為相似，而geNorm分析結(jié)果與NormFinder、BestKeeper分析結(jié)果差異較大。例如，ACT/RPS3a在geNorm中排名為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而在NormFinder中排名分別為第6、第7位，BestKeeper中分別為第4、第6位。藥劑脅迫下，geNorm和NormFinder分析結(jié)果排序結(jié)果均一致，排名前3位的基因均為EIF4A、ACT和EF1α，而這3個(gè)基因在BestKeeper中分別排在第3、第4和第6位。全樣品條件下，geNorm和NormFinder分析結(jié)果表明，EF1α和EIF4A為排名前2位的基因，排在后3位的基因均為G6PDH、β-TUB和β-ACT，其他基因排列順序有少許差異，而BestKeeper分析的基因排序結(jié)果顯示，排在前2位的基因?yàn)镚APDH和EIF4A，與geNorm和NormFinder差異較大。造成3種軟件分析結(jié)果不一致的原因是各軟件計(jì)算原理不同，這種情況在瓜實(shí)蠅（Bactrocera cucurbitae）[32]、松墨天牛（Monochamus alternatus）[33]、大灰象甲（Sympiezomias velatus）[34]、扶桑綿粉蚧[35]等昆蟲中也存在。為了消除不同軟件分析結(jié)果的差異，需利用RefFinder在線分析軟件綜合評(píng)估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，得到最終排名結(jié)果，從中選出最合適的內(nèi)參基因。

根據(jù)RefFinder最終評(píng)價(jià)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)溫度脅迫、藥劑脅迫和全樣品條件下推薦的穩(wěn)定內(nèi)參基因并不完全相同。其中，僅EIF4A在3種條件下都可作為穩(wěn)定內(nèi)參使用。但使用單一內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR數(shù)據(jù)校準(zhǔn)，可能會(huì)影響結(jié)果的精確性，因此qPCR分析過程中往往使用多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正[25， 36]。所需內(nèi)參基因的數(shù)目可根據(jù)geNorm軟件基因配對(duì)差異值Vn/Vn+1來確定。依據(jù)Vn/Vn+1< 0.15的原則，本研究中溫度脅迫、藥劑脅迫和全樣品條件下進(jìn)行qPCR時(shí)均需引入2個(gè)內(nèi)參基因，因此，上述3種處理下推薦的另一個(gè)內(nèi)參基因分別是GAPDH、ACT和EF1α。EIF4A為真核生物啟動(dòng)因子，參與mRNA與核糖體的結(jié)合[37]，已被證實(shí)可用作許多鱗翅目昆蟲溫度脅迫或抗藥性基因的表達(dá)分析，如家蠶（Bombyx mori）中腸抗菌肽基因的表達(dá)[38]、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）抗藥蛋白基因的表達(dá)[39]、蟲草蝙蝠蛾（Thitarodes armoricanus）抗寒基因的表達(dá)[40]等。本研究中EIF4A的適用范圍則更廣泛，說明相同的基因在不同物種中可作為內(nèi)參基因的適用范圍并不一致。另外，GAPDH和ACT作為傳統(tǒng)內(nèi)參基因并非在所有條件下均表達(dá)穩(wěn)定，如在番茄木虱（Bactericera cockerelli）[41]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[42]、二化螟（Chilo suppressalis）[12]、小菜蛾（Plutella xylostella）[43]等昆蟲中二者僅在特定條件下才可作為內(nèi)參基因使用，本研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，GAPDH僅在溫度脅迫下穩(wěn)定，而ACT僅在藥劑脅迫下穩(wěn)定。值得注意的是，王政等[7]發(fā)現(xiàn)茶刺盲蝽在溫度脅迫下最佳內(nèi)參基因?yàn)镋IF4A和RPS3a，藥劑脅迫和全樣品條件下最佳內(nèi)參基因?yàn)镽PS3a和RPL13a，盡管本研究部分實(shí)驗(yàn)方法參照此文，但即使在相同處理?xiàng)l件下結(jié)果卻完全不同，再次表明不同物種的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性存在差異。因此，在進(jìn)行特定條件靶標(biāo)基因qPCR分析時(shí)，必須首先對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行篩選，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

本研究?jī)H對(duì)黃翅絹野螟溫度脅迫、藥劑脅迫及全樣品條件下的內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，其結(jié)果是否適用其他處理?xiàng)l件或其他物種，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果為利用qPCR技術(shù)分析黃翅絹野螟溫敏及抗藥性相關(guān)基因表達(dá)差異提供了穩(wěn)定的內(nèi)參基因，進(jìn)而為基因的功能分析奠定了基礎(chǔ)。

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