六點始葉螨內參基因篩選及其在超氧化物歧化酶基因EsSOD表達分析中的應用

梁曉 陳青 伍春玲 方永軍

摘? 要：為了篩選穩定內參基因分析六點始葉螨超氧化物歧化酶基因EsSOD的表達量，本研究采用geNorm、Bestkeeper、Normfinder和RefFinder軟件分析6個候選內參基因actin、gapdh、rpl13、α-tub、β-tub和18sRNA在六點始葉螨幼螨、前若螨、后若螨和雌成螨中的表達穩定性。結果表明，根據geNorm軟件分析得出6個候選內參引物的穩定性從大到小的排序為：actin>β-tub>rpl13>α-tub>gapdh>18sRNA;根據NormFinder軟件分析得出的穩定性從大到小的排序為：rpl13>β-tub>actin>α-tub>18sRNA>gapdh;根據BestKeeper軟件分析得出的穩定性從大到小的排序為：β-tub>rpl13> actin>gapdh>α-tub>18sRNA;最終根據RefFinder軟件的綜合分析結果，actin和β-tub是穩定性最佳的2個內參引物。分別以actin和β-tub為內參進行EsSOD基因表達量的RT-qPCR分析，結果表明，與取食感螨橡膠樹種質‘IAN2904后EsSOD表達量相比，不同齡期六點始葉螨取食抗螨橡膠樹種質‘IRCI12后EsSOD表達量均降低。本研究獲得了可用于六點始葉螨EsSOD表達量分析的穩定內參引物，為橡膠樹種質抗螨性分子機理研究奠定了理論基礎。

關鍵詞：六點始葉螨;內參基因;超氧化物歧化酶基因EsSOD;基因表達

中圖分類號：S433.5? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to screen stable reference genes in analyzing the expression level of Eotetranychus sexmaculatus superoxide dismutase gene EsSOD， six candidate genes， actin， gapdh， rpl13， α-tub， β-tub and 18SRNA， were analyzed for their expression stability in different life stages （i.e.， larva， protonymph， deutonymph and female adults） of E. sexmaculatus by using geNorm，Bestkeeper， Normfinder and RefFinder analysis methods. The results showed that according to the geNorm analysis， the stability ranking of the six candidate genes was listed as： actin > β-ub > rpl13 > α-tub > gapdh > 18sRNA， according to the NormFinder analysis， the stability ranking of the six candidate genes was listed as： rpl13 > β-tub > actin > α-tub > 18sRNA > gapdh， according to the BestKeeper analysis， the stability ranking of the six candidate genes was listed as： rpl13 > β-tub > actin > α-tub > 18sRNA > gapdh， the order of the stability of six candidate primers was analyzed by BestKeeper software. The qualitative order from large to small was： β-tub > rpl13 > actin > gapdh > α-tub > 18sRNA. Finally， according to the comprehensive analysis results of Reffinder software， actin and β-tub were the best two reference genes， and were subjected to the subsequent RT-qPCR analysis of EsSOD transcription. The results showed that compared with those feeding on mite-susceptible clutivars IAN2904， the expression of EsSOD in mite feeding on mite-resistant clutivars IRCI12 was decreased. Stable reference genes in analyzing the transcription of EsSOD might provide theoretical basis for the study of molecular mechanism of mite resistance in rubber tree.

Keywords： Eotetranychus sexmaculatus; reference gene; superoxide dismutase gene EsSOD; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.024

利用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）方法分析基因相對表達量時，通常需引入一個表達較為穩定的內參基因（reference gene）[1-3]。理想的內參基因應在特定物種的組織、細胞和特定的試驗處理下具有穩定的表達水平。在農業害蟲（螨）的相關功能基因表達水平研究中，已篩選出許多內參基因并經過表達穩定性的驗證[4]。然而，內參基因的選擇和確證因物種或實驗條件而異[5-6]。因此，要分析特定物種在特定處理下的基因表達水平，仍須進行內參基因的篩選以保證結果的準確性。

天然橡膠是關系到國計民生的重要戰略物質，在國防和國民經濟建設中具有不可替代的作用[7-8]。六點始葉螨（Eotetranychus sexmaculatus）是危害我國橡膠樹最嚴重的一種世界危險性害螨[9]。當前，各橡膠產區對于該螨的防治仍依賴于化學藥劑，但橡膠樹高大，藥劑難以靶標，防治難度很大，尋求有效的控制橡膠害螨且符合環保要求的新的防治策略和防治方法，成為當前我國天然橡膠產業發展中亟待解決的重要課題。

培育抗性品種是防治橡膠害螨最經濟、最有效、最簡便的方法，對橡膠樹的抗螨機理進行研究可以為抗螨橡膠樹品種的培育提供理論基礎。前期研究發現抗螨橡膠樹種質‘IRCI12能夠抑制六點始葉螨抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的活性，而感螨橡膠樹種質則不會改變SOD酶的活性[10]，迄今為止，由于尚無六點始葉螨內參基因篩選的相關報道，因此也未能進行六點始葉螨抗氧化酶SOD基因表達水平的驗證。本研究擬分別采用geNorm、NormFinder和BestKeeper和RefFinder 4種軟件[11]用于六點始葉螨取食抗、感螨橡膠樹種質后抗氧化酶基因EsSOD[10， 12]表達量變化RT-qPCR分析的內參基因篩選和評價，為深入闡明橡膠樹種質抗螨的分子機理提供理論和材料支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試六點始葉螨? 供試六點始葉螨為實驗室以感螨參照橡膠樹種質‘IAN2904新鮮葉片繼代飼養的室內種群。將六點始葉螨雌成螨分別接于橡膠樹葉背面，并將葉子放置于長25 cm、寬19 cm的白瓷盤中濕潤海綿上方，同時以濕潤吸水紙圍攏于葉片周圍以防止試螨逃離，每隔3～5 d更換葉片以保證材料新鮮。飼養條件為：人工氣候箱，溫度（25±1）℃，相對濕度為（75±5）%，光照周期14（L）∶10（D）。

1.1.2? ?供試橡膠樹種質? 選用遺傳穩定的抗螨參照橡膠樹種質‘IRCI12和感螨參照橡膠樹種質‘IAN2904為試驗材料[4]。均由中國熱帶農業科學院橡膠研究所國家橡膠種質資源圃提供。

1.1.3? 供試試劑? RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、Mastermix、MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒均為Fermentas公司產品（Fermentas， GlenBurnie， MD）。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取和cDNA第一鏈合成? 總RNA的提取參照Fermentas公司RNA提取試劑盒進行。采用NanoDrop 2000 Spectrophotometer （Thermo， USA）核酸濃度測定儀測定RNA濃度和純度，OD260/280在1.80～2.20之間表示RNA質量較好，并進一步通過1.0%瓊脂糖RNA電泳檢測其完整性。采用經gDNA Eraser （Takara Biochemicals， Dalian， China）處理去除基因組DNA后，取1.0 μg RNA用于第一鏈cDNA的合成。cDNA合成方法參照Fermentas公司的cDNA合成試劑盒進行。RNA和cDNA樣品均保存于-70 ℃超低溫冰箱中。

1.2.2? 六點始葉螨候選內參基因和抗氧化酶基因? 本研究初步選擇的6個候選內參基因actin、gapdh、rpl13、α-tub、β-tub和18sRNA分別為在其他害蟲（螨）研究中已經確定的內參基因[13-15]，抗氧化酶基因為EsSOD。上述7個基因的引物根據實驗室前期經由RNA-seq測序獲得的部分基因序列進行設計，引物和基因序列號等相關信息見表1。

1.2.3? RT-qPCR分析方法? 采用Bio-Rad CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀（Bio-Rad， USA）運行RT-qPCR程序，反應條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。最后在54～95 ℃進行引物溶解曲線分析，經熔解曲線分析確認所設計的引物無非特異擴增及引物二聚體后，將cDNA模板按照3倍稀釋成5個濃度梯度（3?1、3?2、3?3、3?4、3?5）進行標準曲線分析，并根據公式E=[（10（?1/slope）- 1）×100%計算不同引物的擴增效率，同時根據Pfaffl的2?ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[16]，每個處理3次重復。

1.2.4? 候選內參基因的穩定性分析方法? 首先采用分析軟件geNorm、Normfinder和Bestkeeper并參照Niu等[17]建立的方法分別進行候選內參基因的穩定性排序，然后用RefFinder綜合評價上述3種方法的分析結果以避免單個分析方法的片面性，最后根據RefFinder的最終評估結果并結合geNorm分析，可以判定進行特定功能基因RT-qPCR驗證所使用的內參個數[18]。

1.2.5? 六點始葉螨取食抗、感螨橡膠樹種質對抗氧化酶基因表達的影響? 將4個不同齡期（幼螨、前若螨、后若螨和成螨）按200頭/葉分別接種于抗螨參照橡膠樹種質‘IRCI12和感螨參照橡膠樹種質‘IAN2904葉背面，飼養方法參照1.1進行，分別于接種后48 h挑取存活的六點始葉螨樣品，以1.2.4中篩選得到的穩定性最佳的內參基因，采用RT-qPCR分析（參考1.2.3）抗氧化酶基因EsSOD表達量的變化情況。

2? 結果與分析

2.1? 候選內參基因表達水平，引物特異性及RT-qPCR擴增效率分析

擴增效率分析結果表明，6個候選內參基因的PCR擴增效率在94.7%～103.4%之間，并且相關系數（R2）均大于0.990（表2）。RT-qPCR分析結果表明，6個候選內參基因在六點始葉螨不同齡期的循環閾值（Ct）平均值均低于25.0，并且大部分基因的Ct值均在17～22之間，每個基因在不同齡期的Ct值變化幅度較小（標準差?。?。actin和β-tub是表達豐度最高的2個基因，Ct平均值分別為17.8和17.2，而表達豐度最低的基因為gapdh，其Ct平均值為24.9（圖1）。

2.2? 不同齡期六點始葉螨候選內參基因穩定性分析

表3結果表明，根據△Ct分析方法，在六點始葉螨不同齡期6個候選內參引物的穩定性從大到小的排序為：actin>β-tub>rpl13>18sRNA> gapdh>α-tub，actin是穩定性最好的內參基因;根據geNorm軟件分析方法，6個候選內參引物的穩定性從大到小的排序為：actin>β-tub>rpl13>α- tub>gapdh>18sRNA，actin是穩定性最好的內參基因;根據NormFinder軟件分析方法，6個候選內參引物的穩定性從大到小的排序為：rpl13> β-tub>actin>α-tub>18sRNA>gapdh，rpl13是穩定性最好的內參基因;根據BestKeeper軟件分析方法，6個候選內參引物的穩定性從大到小的排序為：β-tub>rpl13>actin>gapdh>α-tub>18sRNA，β-tub是穩定性最好的內參基因。而最終根據RefFinder軟件的綜合分析結果，6個候選內參引物的穩定性從大到小的排序為：actin>β-tub> rpl13>α-tub>gapdh>18sRNA，綜合來看actin是穩定性最佳的內參引物，并且β-tub的分值與actin十分接近，而18sRNA的穩定性最差（圖2）。此外，RefFinder軟件結合geNorm軟件分析結果還表明，V2/3<0.15（V值表示使用n個和n+1個內參引物對RT-qPCR分析結果影響的兩兩變異值，以確定不同樣本中RT-qPCR數據標準化所需的最佳內參基因個數，當V<0.15時的n值即表示分析使用的最佳內參基因為n個），因此同時使用actin和β-tub 2個基因為內參已完全滿足后續RT-qPCR分析的要求（圖3）。

2.3? 內參基因穩定性驗證

分別以2.1中篩選出的actin、β-tub、actin+ β-tub組合作為穩定的內參，同時以18sRNA為不穩定內參，研究不同齡期六點始葉螨取食抗、感螨橡膠樹種質后EsSOD基因表達量的變化。結果表明，不同齡期六點始葉螨幼螨取食抗螨橡膠樹種質‘IRCI12后，體內EsSOD基因表達量較取食感螨橡膠樹種質‘IAN2904均有所下降，其中分別以actin、β-tub、actin+β-tub組合作為內參時，幼螨、前若螨、后若螨和成螨EsSOD基因表達量下降百分率分別為26.3%、33.5%、36.8%和56.2%，25.3%、35.5%、38.2%和51.7%，22.6%、34.9%、37.5%和53.3%（圖4），均沒有超過58%;而以18sRNA作為內參時，幼螨、前若螨、后若螨和成螨取食抗螨橡膠樹種質‘IRCI12后EsSOD基因表達量分別為取食‘IAN2904的58.5%、78.5%、74.9%和88.3%（圖4），均在58%以上。上述結果表明，以actin、β-tub、actin+β-tub組合作為內參分析EsSOD基因表達量變化水平可以獲得較為一致的結果。

3? 討論

準確穩定的RT-qPCR分析除了需要合理的試驗與引物設計之外，試驗過程中還應注意確保高的RNA提取質量、高的聚合酶的擴增效率、減少cDNA合成以及PCR準備過程中的操作誤差，避免樣品污染等因素[19]。此外，選擇合適的內參基因也尤為重要。由于受物種和試驗處理條件的差異，不存在完全通用的、恒定表達的內參基因。由于迄今為止尚無六點始葉螨內參基因篩選的相關報道，因此課題組選擇的6個內參基因均為其他葉螨科（Tetranychidae）研究中常用的或者已經確定的可用于RT-qPCR分析的內參基因。例如楊麗紅[20]對柑橘全爪螨的研究結果表明，在不同發育階段穩定性較好的是RpII，在低溫脅迫和高溫脅迫下穩定性較好的分別是α-tubulin和RpII。Yang等[21]研究了10個候選內參基因在二斑葉螨不同發育階段的表達穩定性，結果表明PRL13和v-ATPase是穩定性最佳的2個內參。岳秀利等[22]篩選了8個內參基因[18sRNA， α-tubulin， β-actin， ELF， gapdh， rpl13a， SDHA （succinate dehydrogenase complex， subunit A）， TBP （TATA-box- binding protein）]用于二斑葉螨解毒酶基因表達水平的分析，結果表明，α-tubulin的穩定性最好。周興隆等[23]對二斑葉螨多重抗性品系最優內參基因進行篩選，并應用于CYP392A亞家族基因的表達分析，結果表明，最佳內參基因為EFLn。由此可見，即便針對同一物種，在不同的試驗處理下，內參基因的選擇也有較大的差異，因此，必須根據不同的試驗對象、試驗目的和試驗條件選擇合適的內參基因。

當前用于內參穩定性評價的3種主流軟件分別是geNorm、NormFinder和BestKeeper。本研究中3種軟件評價結果存在一定的差異，geNorm分析得出actin是穩定性最好的內參，NormFinder分析得出rpl13是穩定性最好的內參，BestKeeper分析獲得β-tub是穩定性最好的內參。最終應用RefFinder整合geNorm、NormFinder和BestKeeper的分析結果，最終得出actin和β-tub是穩定性最好的2個內參。分別以這2個內參單獨使用、同時使用驗證不同齡期六點始葉螨取食抗、感螨橡膠樹品種后EsSOD基因的表達水平，發現actin、β-tub內參無論單獨或組合分析均表明EsSOD基因表達量在害螨取食抗螨種質時均低于取食感螨種質，并且均低于采用穩定性最差的內參18sRNA分析獲得的結果。前期研究表明，不同齡期六點始葉螨取食抗螨橡膠樹品種‘IRCI12后體內SOD酶活性相比取食感螨橡膠樹品種‘IAN2904顯著降低[10]，本研究中分析得到的EsSOD基因表達變化趨勢與之前的酶活變化趨勢具有一致性，可為橡膠樹種質抗螨性分子機理研究奠定理論基礎。

參考文獻

Yoo W G， Kim T I， Li S， et al. Reference genes for quantitative analysis on Clonorchis sinensisgene expression by real-time PCR[J]. Parasitology Research， 2009， 104（2）： 321-328.

Haller F， Kulle B， Schwager S， et al. Equivalence test in quantitative reverse transcription polymerase chain reaction： Confirmation of reference genes suitable for normalization[J]. Analytical Biochemistry， 2004， 335（1）： 1-9.

Ransbotyn V， Reusch T B H. Housekeeping gene selection for quantitative real-time PCR assays in the seagrass Zostera marina， subjected to heat stress[J]. Limnology & Oceanography Methods， 2006， 4（10）： 367-373.

陳? 芳， 陸永躍. 熱脅迫下棉花粉蚧內參基因的篩選[J]. 昆蟲學報， 2014， 57（10）： 1146-1154.

Bo-Ra Kim， Hee-Young Nam， Soo-Un Kim， et al. Normalization of reverse transcription quantitative-PCR with house keeping genes in rice[J]. Biotechnology Letters， 2003， 25（21）： 1869-1872.

Marum L， Miguel A， Ricardo C P， et al. Reference gene gelection for quantitative real-time PCR normalization in Quercus suber[J]. PLoS One， 2012， 7（4）： e35113.

孫曉艷. 橡膠產業海內外發展的優劣勢分析——以廣東農墾為例[J]. 中國農墾， 2019（3）： 39-42.

佘時英. 2008年我國天然橡膠產業狀況與形勢分析[J]. 世界熱帶農業信息， 2008（8）： 11-14.

張方平， 朱俊洪， 李? 磊， 等. 不同生長期橡膠葉對六點始葉螨選擇性及種群增長影響[J]. 熱帶作物學報， 2016， 37（1）： 153-157.

Lu F P， Chen Z S， Lu H， et al. Effects of resistant and susceptible rubber germplasms on development， reproduction and protective enzyme activities of Eotetranychus sexmaculatus （Acari： Tetranychidae）[J]. Experimental & Applied Acarology， 2016， 69（4）： 427-443.

Pfaffl M W， Tichopad A， Prgomet C， et al. Determination of stable housekeeping genes， differentially regulated target genes and sample integrity： BestKeeper-Excel-Based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters， 2004， 26（6）： 509-515.

張會英. 橡膠樹種質抗螨性及其機理研究[D]. ?？冢?海南大學， 2014.

Sun W， Jin Y， He L， et al. Suitable reference gene selection for different strains and developmental stages of the carmine spider mite， Tetranychus cinnabarinus， using quantitative real-time PCR[J]. Journal of Insect Science， 2010， 10（4）： 1-12.