雷公藤甲素固體脂質納米粒的制備及其抗慢性皮炎濕疹的作用研究

汪五清 賀燕妮 曾義斌 張彤 朱瑞政 左付國

摘 要 目的：制備雷公藤甲素固體脂質納米粒（triptolide-solid lipid nanoparticles， TPL-SLN），并考察其抗慢性皮炎濕疹的作用。方法：以Compritol 888 ATO為油相、Tween 80為表面活性劑、大豆卵磷脂和Transcutol HP為助表面活性劑，通過處方篩選，制備TPL-SLN。以不同濃度的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液為致敏劑和激發劑，建立小鼠耳部慢性皮炎濕疹模型，考察TPL-SLN對慢性濕疹造成的腫脹癥狀以及對血清中細胞因子分泌的影響。結果：本研究制備的TPL-SLN粒徑為（90.69±1.82）nm，且分布均勻，能有效抑制小鼠皮炎濕疹造成的耳腫脹癥狀，可顯著降低皮膚炎性因子IFN-g、IL-4的表達。結論：本研究制備的TPL-SLN能夠有效改善小鼠皮炎濕疹癥狀，有望為雷公藤甲素治療慢性皮炎濕疹提供一種新的給藥策略。

關鍵詞 雷公藤甲素 固體脂質納米粒 納米經皮給藥系統 慢性皮炎濕疹

中圖分類號：R979.5； R944.9 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）01-0014-05

*基金項目：上海市衛生局中醫藥科研基金項目（2012L073A）

Development of triptolide-solid lipid nanoparticles for treating chronic dermatitis eczema*

WANG Wuqing1**， HE Yanni1， ZENG Yibin1， ZHANG Tong1， ZHU Ruizheng1， ZUO Fuguo2***（1. Department of Dermatology， the Central Hospital of Minhang District， Shanghai 201100， China； 2. Department of Dermatology， East Hospital， School of Medicine， Tongji University， Shanghai 200120， China）

ABSTRACT Objective： To prepare triptolide-solid lipid nanoparticles （TPL-SLN） and investigate their effect on chronic dermatitis and eczema. Methods： Triptolide-solid lipid nanoparticles were prepared using Compritol 888 ATO as the oil phase， Tween 80 as the surfactant， soybean lecithin and Transcutol HP as the co-surfactant. A mice model with chronic ear dermatitis and eczema was established by sensitizing and stimulating using 2，4-dinitrochlorobenzene solution with different concentration to investigate their effect on swelling， skin redness and the serum concentrations of IFN-γ， IL-4 and IL-8. Results： The prepared TPL-SLN had a particle size of 90.69±1.82 nm and a uniform distribution， and could effectively inhibit the ear swelling， erythema and other symptoms caused by dermatitis and eczema in mice and significantly reduce the expression of skin inflammatory factors IFN- and IL-4. Conclusion： The TPL-SLN can effectively improve the symptoms of dermatitis and eczema in mice and is expected to provide a new delivery strategy for triptolide for the treatment of chronic dermatitis and eczema.

KEy WORDS triptolide； solid lipid nanoparticles； nano transdermal drug delivery system； chronic dermatitis eczema

雷公藤甲素（triptolide，TPL）是中藥雷公藤的主要活性成分，具有抗炎、鎮痛、免疫調節、抗腫瘤等理化性質，常用于皮膚濕疹、類風濕性關節炎、免疫性疾病及惡性腫瘤等[1-2]。目前上市的雷公藤制劑有雷公藤片、昆仙膠囊、雷公藤多苷片、昆明山海棠片等，但雷公藤的傳統口服制劑存在半衰期（t1/2）短、生物利用度低、不良反應大等問題[3]。而經皮給藥制劑具有避免肝臟“首過效應”、延長藥物t1/2、降低藥物不良反應等特點，因此，將雷公藤甲素制備成外用制劑是提高局部藥物濃度、降低不良作用的重要途徑。

皮膚對藥物的屏障作用是阻礙外用制劑發揮療效的重要因素，而將藥物制備成納米制劑是采用制劑方法促透皮的重要手段。其中固體脂質納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）可將藥物包封于類脂核中，SLN不僅具備脂質體的安全性，同時還具有聚合物納米粒的穩定性，可實現藥物的緩、控釋和靶向遞送[4]。因此，本研究以TPL為模型藥物制備TPL-SLN，并對其抗皮膚慢性濕疹的藥效學進行考察。

2）分組及給藥 將54只雄性ICR小鼠隨機分為6組：空白對照組，模型組，TPL-SLN低（15 mg/kg）、中（45 mg/kg）、高劑量組（90 mg/kg）和雷公藤多苷片組（10 mg/kg）。按上述慢性皮炎濕疹方法造模，小鼠于致敏后開始給藥，每日1次，連續給藥14 d?？瞻讓φ战M和模型組給予不含藥的SLN處理；實驗組分別局部給予低、中、高濃度的TPL-SLN；雷公藤多苷片組通過灌胃給藥。并于每次激發后測量每組小鼠的耳厚度。

3）皮膚炎性因子的測定 于最后一次激發24 h后處死小鼠，斷頭取血置于肝素管中，于3 000 r/min條件下離心30 min，上層血清保存于-80 ℃冰箱中備用。采用ELISA試劑盒測定血清中炎性因子IFN-g、IL-4和IL-8的含量。

2 結果

2.1 方法學驗證

HPLC測定不同濃度（c，2、4、6、8、10 mg/ml）雷公藤甲素溶液的峰面積（A），測得TPL在2～10 mg/ml濃度范圍內的線性關系為：A=41.786c-3.979，R2=0.999 8（n=5）。經方法學驗證，本研究建立的HPLC含量測定方法的精密度、穩定性、重復性、回收率等均符合要求。

2.2 TPL-SLN處方優化

2.2.1 脂質載體的選擇

通過考察TPL在不同固體脂質中的溶解性發現TPL在硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、Compritol 888 ATO、棕櫚酸中的油水分配系數分別為1.12±0.05、0.72±0.08、1.72±0.08和1.43±0.06，結果表明TPL在Compritol 888 ATO中的具有較高的溶解度。因此，確定Compritol 888 ATO為脂質材料。

2.2.2 助表面活性劑的篩選

通過考察大豆卵磷脂與常見的幾種助表面活性劑的互溶情況確定助表面活性劑的種類，結果表明正己醇和Transcutol HP均能和大豆卵磷脂互溶，但正己醇對皮膚、黏膜具有刺激性。因此，本研究以Transcutol HP和大豆卵磷脂（1∶1）作為助表面活性劑。

2.2.3 表面活性劑/助表面活性劑的比例確定

繪制KM值為1∶1，2∶1，3∶1的偽三元相圖，根據乳化面積的大小確定表面活性劑和助表面活性劑的比例，結果表明，當KM=2∶1時，該體系具有較好的乳化能力（圖1），即表面活性劑（Tween 80）和助表面活性劑的（大豆卵磷脂-Transcutol HP=1∶1）比例確定為2∶1。

2.2.4 脂質與表面活性劑的比例

結果表明，脂質材料增加，包封率無顯著變化（P>0.5，表1），但載藥量出現逐漸降低的趨勢（P<0.5，表1），考慮到藥物的利用率，本研究中Compritol 888 ATO和Tween 80的用量比為1∶2。

2.2.5 藥脂比的確定

結果表明，隨著投藥量的增加，SLN對藥物的包封率逐漸降低，而載藥量有上升的趨勢，綜合藥脂比對這2種指標的影響，確定藥物的用量為脂質載體的10%。

2.3 TPL-SLN理化性質表征

2.3.1 粒徑分布

制備的TPL-SLN粒徑較小，大小為（90.69±1.82）nm；粒徑均勻，呈正態分布，PDI為（0.106±0.018）nm（圖2）。

2.3.2 包封率、載藥量的測定

測得的SLN對TPL的包封率、載藥量分別為

（96.38±7.96）%，（10.21±0.98）%。

2.4 TPL-SLN藥效學研究

1）小鼠耳慢性皮炎濕疹模型的構建 最后一次激發后，對照組和模型組小鼠的耳厚度分別為（0.236±0.009）mm和（0.333±0.016）mm（P<0.01，圖3），表明ICR小鼠經不同濃度的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液致敏、激發處理后，能成功引發小鼠耳慢性皮炎濕疹。

2）分組及給藥 每只小鼠于每次激發后測量耳厚度，連續測定10 d，結果表明，對照組小鼠耳厚度無明顯變化，而模型組小鼠出現明顯腫脹的現象；小鼠經TPL-SLN低劑量組處理后，耳厚度與模型組之間無顯著性差異；而與模型組相比，經TPL-SLN中、高劑量組以及雷公藤多苷片處理的小鼠耳腫脹癥狀明顯改善（表3）。

3）皮膚炎性因子的測定 經2， 4-二硝基氯苯丙酮溶液致敏、激發處理后，與對照組相比，模型組中IFN-g、IL-4含量明顯升高；與模型組相比，TPL-SLN中、高劑量組和雷公藤多苷片組能顯著降低IFN-g、IL-4的血清含量（圖4）。結果顯示，小鼠耳部經致敏、激發，以及不同制劑處理后，血清中的IL-8含量無明顯變化，表明小鼠耳慢性皮炎濕疹與炎性因子IL-8直接關系（圖4）。

3 討論

SLN的制備方法有高壓均質法、超聲法、乳化蒸發-低溫固化法、薄膜分散發、微乳法等[11-13]。與其他制備方法相比較，采用微乳法制備TPL-SLN具有流程簡單、縮短制劑制備時間、不殘留有機溶劑、對儀器要求低等特點。本研究通過處方篩選，采用微乳法制備的納米載體具有粒徑小，分布均勻，包封率和載藥量高等特點。

本研究以濃度為7%的2， 4-二硝基氯苯丙酮溶液對實驗動物致敏，致敏后再經低濃度的2， 4-二硝基氯苯丙酮溶液多次激發，成功建立ICR小鼠慢性皮炎濕疹模型。藥效學結果表明，本研究制備的TPL-SLN高劑量能明顯改善模型小鼠的炎癥反應，緩解甚至消除模型動物的耳腫脹癥狀，與陽性對照藥雷公藤多苷片效果相當。

目前，導致皮炎濕疹的作用機制較為復雜，而機體的免疫系統在其中發揮了必不可少的作用并受到一定的影響。其中，細胞因子作為免疫調節的重要成分，通過測定其表達的水平，可考察TPL-SLN在治療慢性皮炎濕疹中的部分作用機制。ELISA結果顯示，TPL-SLN能顯著降低血清中TNF-γ和IL-4的表達，而對IL-8的分泌未見有明顯調控作用。結果表明TPL-SLN可調節T細胞亞群的失衡情況，治療機制可能與調節T、B淋巴細胞有關[14]。

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