基于ISSR標記的火龍果種質資源遺傳多樣性分析

武志江 黃鳳珠 黃黎芳 陸貴鋒 梁桂東 李禎英 劉朝安 鄧海燕

摘? 要：為明確火龍果種質資源的遺傳多樣性水平和親緣關系，以69份火龍果核心種質為研究對象，采用ISSR分子標記進行火龍果遺傳分析。結果表明：13條ISSR引物共檢測到247個位點，其中多態性位點數為232個，多態性條帶百分比（PPB）為93.93%，平均多態性信息含量（PIC）為0.9189;平均觀測等位基因數（Na）為1.9084，有效等位基因數（Ne）為1.4606，期望雜合度（He）為0.2750，Nei氏基因多樣性（H）為0.2616，香農信息指數（I）為0.4190。火龍果種質資源的遺傳距離為0.0707～0.6741。基于遺傳距離聚類分析結果，火龍果種質資源分為6大類群，第Ⅰ類群為紅皮白肉類型，包括25份種質;第Ⅱ類群有19份種質，全部為紅肉或紫紅肉類型，包括紅皮、青皮、橘黃皮類型;第Ⅲ類群包含類型較雜，包括粉肉、雙色類型和水晶系列品種;第Ⅳ大類為黃皮白肉類型;第Ⅴ類和第Ⅵ類群均僅有一個種質，單獨自聚一類。研究結果為火龍果種質資源的分類、保存與利用、遺傳進化等研究及雜交組合選配提供理論指導和技術支持。

關鍵詞：火龍果;ISSR;遺傳多樣性;親緣關系;種質資源

中圖分類號：S667.9? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to clarify the level of genetic diversity and relationship of pitaya germplasm resources， 69 core collections of pitaya were used as the research materials， and ISSR molecular markers were used to analyze the genetic characterizaiton of pitaya. The results showed that a total of 247 loci were detected by 13 ISSR primers， of which 232 loci were polymorphic. The percentage of polymorphic bands （PPB） was 93.93%， and the average polymorphism information content （PIC） was 0.9189. The average observed number of alleles （Na）， effective number of alleles （Ne）， expected heterozygosity （He）， Nei's gene diversity （H） and Shannon information index （I） was 1.9084， 1.4606， 0.2750， 0.2616 and 0.4190， respectively. The genetic distance varied from 0.0707 to 0.6741. Six groups were distinguished by truncating the dendrogram. Grop I contained 25 accessions， which were white pulp genotypes. Group II contained 19 red （purple red） pulp accessions， including red， green， and orange peel genotypes. Group III contained miscellaneous genotypes， including pink pulp， two-color type and crystal series varieties. Both group V and group VI had only one accession and were self-clustered， respectively. The results would provide theoretical guidance and technical support for the classification， conservation and utilization， genetic evolution and hybrid combination selection of pitaya germplasm resources.

Keywords： pitaya; ISSR; genetic diversity; genetic relationship; genetic resources

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.007

火龍果（pitaya， pitahaya）是世界上一種獨特的保健型熱帶水果，屬雙子葉植物綱石竹目仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）或蛇鞭柱屬（Selenicereus）多年生攀緣植物，兼具熱帶沙漠和雨林植物特性，起源于熱帶中南美洲地區，后傳入越南、泰國等東南亞國家和中國臺灣[1]。火龍果集水果、花卉、蔬菜、保健、醫藥于一體[2]，具有多批次開花結果習性，自然季花果期長達半年，其產能潛力和經濟效益高，市場容量大。近年來，我國火龍果產業規模不斷壯大，據2019年統計數據，全國火龍果種植面積已發展到5萬余公頃，主要集中在南方地區，包括廣西、廣東、海南、貴州、云南、福建、臺灣等熱帶、南亞熱帶地區。目前火龍果生產上的栽培品種大多從中國臺灣、越南引進，以紅皮白肉和紅皮紅肉2種類型為主，品種結構單一且種質資源遺傳基礎狹窄[3-4]，因此需要加強對火龍果種質資源的收集保護、挖掘利用及良種選育等工作。然而，火龍果在種質資源引進和發展過程中存在品種名稱混亂、來源記載不詳等問題，同時現有種質資源的遺傳背景不清，親緣關系不明，挖掘利用力度不夠，嚴重阻礙了火龍果新品種的選育進度。因此，為了加強火龍果種質資源的管理、提高研究和利用效率，有必要針對火龍果種質資源開展遺傳多樣性分析，有利于更有效地挖掘和利用優異種質資源，提高育種效率。

ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）又稱簡單重復序列間擴增，Zietkiewicz等[5]開發的一種基于微衛星序列的分子標記，具有操作簡單、成本低、多態性豐富、穩定性較高等特點，已廣泛用于遺傳多樣性和居群遺傳機構、遺傳指紋圖譜或分子身份證構建等研究[6]。目前在火龍果種質資源的遺傳分析上已有不少文獻報道，而不同的研究者其保存的種質資源存在差異，所采用的分子標記類型也不一，其中包括RAPD[7]、AFLP[8]、ISSR[9]、SSR[10]等。本課題組早在2012年就已開始收集火龍果種質資源，目前已收集保存的火龍果種質資源達200余份，并于2016年7月被認定為“農業農村部南寧火龍果種質資源圃”，成為廣西首批農業農村部認定授牌的果樹種質資源圃，是我國火龍果種質資源保存和研究的重要基地。

本研究選取農業農村部南寧火龍果種質資源圃中69份核心種質作為研究對象，采用ISSR分子標記技術對其進行遺傳多樣性評估，以期闡明種質資源之間的親緣關系，更全面地了解火龍果種質資源的遺傳背景，為火龍果種質資源的分類、保存與利用、遺傳進化等研究及雜交組合的親本選配提供理論指導和技術支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料均來源于農業農村部南寧火龍果種質資源圃，基于前期表型性狀鑒定，從圃中篩選出69份核心種質（表1）作為研究對象，于2019年4月采取健康嫩莖的莖尖作為供試組織材料，采后于–76 ℃冰箱中保存備用。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA的提取? 采用改良CTAB法，每個火龍果嫩莖組織樣品稱取0.12～0.2 g，放置2 mL EP管中，剪碎，加入1 mL CTAB，組織研磨儀研磨;65 ℃水浴60 min，其間振蕩混勻2～3次;12 000 r/min離心5 min，吸取上清轉入新的2 mL離心管中，加入300 μL水飽和酚，300 μL氯仿劇烈震蕩混勻，室溫放置5～10 min;12 000 r/min離心10 min，吸取上清，重復步驟3操作1次;上清液用等體積氯仿抽提1次;12 000 r/min離心10 min，吸取上清，加入1/10 3 mol/L醋酸鈉和0.8倍體積的異丙醇沉淀DNA;12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗2遍，晾干，用200～500 μL TE溶解DNA。

1.2.2? ISSR-PCR擴增? PCR擴增所用的100條ISSR引物來源于哥倫比亞大學（University of British Columbia， UBC）公布的第9套ISSR引物（801-900），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于多態性引物篩選。ISSR-PCR反應體系為20 μL，包含2×Taq PCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L引物1 μL、模板DNA 10 ng。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，（Tm–5）℃（根據引物而定）退火45 s，72 ℃延伸90 s，共37個循環，循環結束后4 ℃保存。PCR擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以5 V/cm的電壓電泳40 min。電泳后用JS-1075x型凝膠成像系統觀察結果，拍照保存。

1.3? 數據分析

根據凝膠中條帶遷移的位置和有無進行統計，將清晰度好的條帶賦值“1”，無條帶賦值“0”，構建原始數據矩陣，統計每條引物擴增條帶數和多態性條帶數，計算多態性條帶百分比（PPB）。采用GenAIEx 6.5和POPGENE 1.32進行數據統計分析，計算觀測等位基因數（Na），有效等位基因數（Ne），期望雜合度（He），香農信息指數（I）和Nei氏基因多樣性（H）等遺傳多樣性參數和。多態性信息含量（PIC）的計算參考Milbourne等[11]的方法進行，計算公式如下。各參數間的相關性分析通過IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行計算。將0/1代碼序列轉化為A/C堿基序列，利用MEGA 10.1.6軟件計算遺傳距離（genetic distance），采用UPGMA（Unwired pair-Group method with Arithmetical Averages）方法進行聚類分析，構建系統發育樹。Bootstrap的初始值設為1000以檢驗發育樹分支的可信度。

其中，Pij是第i個標記的第j個等位基因的頻率。

2? 結果與分析

2.1? ISSR引物的多態性分析

從100條ISSR通用引物中篩選到多態性豐富、重復性好并且能擴增條帶清晰的引物13條（表2），分別對69份火龍果種質進行多態性檢測，擴增出多個位點且條帶清晰，不同種質間有很多特異性條帶（圖1是引物UBC810的PCR擴增產物電泳圖）。13條引物共檢測到247個位點，其中多態性位點數為232個，多態性條帶百分比（PPB）為93.93%。引物的擴增位點數為15～25，平均每個引物擴增19個位點，其中擴增位點最多的是UBC900，最少的是UBC844。引物的多態性信息含量（PIC）為0.8884～0.9408，平均PIC為0.9189，其中UBC813最大，UBC844最小（表2）。

2.2? 種群遺傳多樣性分析

69份火龍果種質資源的平均觀測等位基因數（Na）為1.9084，有效等位基因數（Ne）為1.4606，期望雜合度（He）為0.2750，Nei氏基因多樣性（H）為0.2616，香農信息指數（I）為0.4190（表2），這表明火龍果種質資源具有較豐富的遺傳多樣性。另外，為確定PPB和PIC是否適合用作評估火龍果種群遺傳多樣性的參數，對各參數間的相關性進行顯著性分析，結果顯示，PPB和PIC與Na、Ne、He、H、I的相關性均不顯著（表3），因此PPB和PIC不適合評估火龍果種群遺傳多樣性。

2.3? 種質間遺傳距離分析

69份火龍果種質資源之間的遺傳距離為0.0707～0.6741，呈正態分布，平均遺傳距離為0.3605，其中遺傳距離在0.24～0.48之間的居多，所占頻率為86.02%（圖2）;遺傳距離大于0.64的頻率僅為0.09%（圖2）。這表明大部分的種質資源遺傳距離分布較為集中且距離較小，親緣關系較近。另外，遺傳距離小于0.08的種質可能來源于同一親本或為同一品種的繁殖材料。

2.4? 聚類分析

采用UPGMA方法進一步對69份火龍果進行聚類分析（圖3）。由圖3可知，將69份種質資源分為6大類群，第Ⅰ大類為紅皮白肉類型，包括25份種質，屬于量天尺屬;第Ⅱ大類有19份種質，全部為紅肉或紫紅肉類型，包括紅皮、青皮、橘黃皮類型，屬于量天尺屬;第Ⅲ大類包含類型較雜，進一步聚類可分為粉肉、雙色類型和水晶系列品種，水晶系列又可聚類分為白水晶和紅水晶兩類，均屬于量天尺屬，這一類群處于紅肉和白肉類型之間，可能為二者雜交后代;第Ⅳ大類為黃皮白肉類型，包括燕窩果（60）、黃龍果（21）、上海黃龍（36）等，屬于蛇鞭柱屬或量天尺屬;第Ⅴ類僅有一個種質黑龍（2），單獨聚為一類，屬于蛇鞭柱屬的一個種。第Ⅵ類也僅有一個種質糖龍（63），此種質來自美國，其生物學特性和果實性狀均比較特別，可能屬于量天尺屬。

3? 討論

本研究采用ISSR分子標記對69份國內外收集的核心火龍果種質資源的遺傳多樣性及親緣關系進行評估分析。本研究從100條哥倫比亞大學設計的ISSR通用引物中篩選出多態性豐富、擴增條帶清晰的引物13條，其中UBC810、UBC825和UBC873是前人在火龍果遺傳分析上應用最多的ISSR引物[9， 12-14]，而UBC822、UBC843、UBC852和UBC854是本研究新篩選出來的ISSR引物。另外，本研究篩選出的ISSR引物平均每個擴增19個位點，與其他火龍果研究數據相比擴增的位點相對較多，這可能與火龍果種質資源不同或退火溫度存在差異有關。依據PIC值大小與基因多態性高低的相關性[15]，本研究所用的ISSR引物的PIC值均高于0.5，屬于高度多態性位點，這與Tao等[9]基于表型和ISSR評估火龍果遺傳多樣性的結果一致。本研究中69份火龍果種質資源的平均觀測等位基因數（Na）為1.9084，有效等位基因數（Ne）為1.4606，期望雜合度（He）為0.2750，Nei氏基因多樣性（H）為0.2616，香農信息指數（I）為0.4190，此結果與具有較高遺傳多樣性的野生桃兒七的ISSR參數大小相近[16]，這表明火龍果種質資源具有較豐富的遺傳多樣性。另外，為確定PPB和PIC是否適合用作評估火龍果種群遺傳多樣性的參數，對各參數間的相關性進行了顯著性分析，結果顯示PPB和PIC與Na、Ne、He、H、I的相關性均不顯著，因此PPB和PIC不適合評估火龍果種質資源的遺傳多樣性，本結果與Pan等[10]有關火龍果SSR的文獻報道不盡相同，他們發現PIC可用于評估其遺傳多樣性，而PPB不能，這一差異可能與所采用的分子標記類型不同有關。

基于ISSR聚類分析，本研究將火龍果種質資源分為6大類群，基本符合植物分類學結果。第Ⅰ類群（紅皮白肉類型，25份）、第Ⅱ類群（紅皮紅肉或紫紅肉類型，19份）和第Ⅳ類群（黃皮類型，3份）的聚類結果與其他研究者們[8-10， 12-14， 17-18]基于分子標記對火龍果的研究結果完全一致，基于果肉顏色分為白肉和紅肉類型，基于果皮顏色分為紅皮和黃皮類型。

在第Ⅱ類群中有2個主栽商業化品種‘軟枝大紅（55）和‘金都1號（52）聚在一起，表明這2個品種的親緣關系較近，且形態學鑒定其植物學特性和開花結果習性均非常接近，推斷可能來源于同一親本或同一品種的不同繁殖材料。另外，紅肉類型中的‘青皮（62）和‘橘黃皮（61）紅肉火龍果與其他紅皮紅肉火龍果遺傳距離較遠，且單獨聚為一小類，這一結果與基于表型性狀差異進行植物學分類地位相一致，尤其‘青龍的花色為紅色，花瓣細長，與其他火龍果的花外形非常不同。據Le Bellec等[19]報道‘青龍（62）的拉丁學名為Hylocereus stenopterus，而據果實性狀的差異‘橘龍（61）應歸類為量天尺屬（Hylocereus）的另外一個種。

第Ⅳ類群的黃皮火龍果均為四倍體類型（已鑒定，數據未發表），其表型兼具蛇鞭柱屬和量天尺屬的特征，已有文獻報道其為蛇鞭柱屬和量天尺屬自然雜交形成的異源四倍體[20]，目前大部分火龍果專家將其歸類為量天尺屬，但以色列火龍果專家則認為根據其表型更應該將其歸類為蛇鞭柱屬。

第Ⅲ類群包含的類型較雜，這一類群處于紅肉和白肉類型之間，其中粉肉品種（34、37、28）和雙色品種（23、41、31、40）可能為紅肉和白肉的屬內種間雜交選育種或芽變品種。另外水晶系列的品種也聚為此類群，其中‘白水晶和‘紅水晶品種各自聚為一類，說明這2個品種親緣關系既較近又存在一定的遺傳距離。從植物學形態來看，水晶類種質在莖蔓、花和果實上與普通火龍果存在明顯差異，其花果帶少量刺、花細長，而成熟莖蔓近圓柱型，兼具量天尺屬和蛇鞭柱屬的特征;從聚類分析結果看，整體上處于蛇鞭柱屬和量天尺屬之間，而且單獨成類，與紅白肉種間雜種的聚類結果頗為相似，推斷其為二倍體量天尺屬和二倍體蛇鞭柱屬的屬間雜交后代，此結論進一步支持了黃鳳珠等[21]的觀點。

第Ⅴ類和第Ⅵ類群均僅有一個種質，單獨自聚一類，分別為‘黑龍（2）和‘美國糖龍（63）。‘黑龍為二倍體火龍果（已鑒定，數據未發表），與黃皮蛇鞭柱屬的遺傳距離較小，親緣關系較近。蛇鞭柱屬火龍果原產于中南美洲帶地區的肉質莖灌木，與量天尺屬形態特征差異非常明顯，蛇鞭柱屬的枝條一般呈近圓柱形或多棱柱形，比量天尺屬的枝條更為纖長，果皮長有大量的刺和剛毛[20]。因此，綜合考慮植物形態和聚類分析結果，‘黑龍應屬于蛇鞭柱屬。‘美國糖龍為四倍體火龍果（已鑒定，數據未發表），是新引進的一個國外稀有品種，其植物學形態特征與蛇鞭柱屬很接近，果皮呈暗紅色、無刺，果肉呈紅色，與其他紅肉火龍果外形差異明顯，其他生物學特性有待進一步觀察。

據相關文獻報道，火龍果量天尺屬包括17個種，蛇鞭柱屬有20個種[18， 22]。國內引進的大部分火龍果以商業化主栽品種為主，因此資源圃從國內收集保存的火龍果種類非常少，本研究中85%以上的種質資源的遺傳距離在0.24～0.48之間，這表明大部分的種質資源遺傳距離分布較為集中且距離較小，親緣關系相對較近，遺傳基礎比較狹窄。這與火龍果原生種的獲取途徑有限以及國外對本國種質資源的保護限制有關。因此，對于國內火龍果育種者來說，國外原生種資源的引進和自主知識產權品種的選育是未來火龍果育種工作的重中之重。

參考文獻

田新民， 李洪立， 何? 云， 等. 火龍果研究現狀[J]. 北方園藝， 2015， 39（18）： 188-193.

Ortiz-Hernández Y D， Carrillo-Salazar J A. Pitahaya （Hylocereus spp.）： A short review[J]. Comunicata Scientiae， 2012， 3（4）： 220-237.

董美超， 岳建強， 李進學， 等. 火龍果育種研究進展[J]. 熱帶農業科學， 2013， 33（5）： 56-59.

申世輝， 馬玉華， 蔡永強. 火龍果研究進展[J]. 中國熱帶農業， 2015（1）： 48-52.

Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20（2）： 176-183.

朱巖芳， 祝水金， 李永平， 等. ISSR分子標記技術在植物種質資源研究中的應用[J]. 種子， 2010， 29（2）： 55-59.

Junqueira K P， Faleiro F G， Junqveira N T V， et al. Genetic diversity of native pitaya native from brazilian savannas with basis on RAPD markers[J]. Revista Brasileira de Fruticultura， 2010， 32（3）： 819-824.

Pagliaccia D， Vidalakis G， Douhan G W， et al. Genetic characterization of pitahaya accessions based on amplified fragment length polymorphism analysis[J]. HortScience， 2015， 50（3）： 332-336.

Tao J， Qiao G， Wen X P， et al. Characterization of genetic relationship of dragon fruit accessions （Hylocereus spp.） by morphological traits and ISSR markers[J]. Scientia Horticulturae， 2014， 170： 82-88.

Pan L M， Fu J X， Zhang R， et al. Genetic diversity among germplasms of Pitaya based on SSR markers[J]. Scientia Horticulturae， 2017， 225： 171-176.

Milbourne D， Meyer R， Bradshaw J E， et al. Comparison of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato[J]. Molecular Breeding， 1997， 3（2）： 127-136.

袁亞芳， 陳明賢， 陳清西， 等. 福建地區火龍果種質資源調查及ISSR分析[J]. 中國農學通報， 2013， 29（34）： 216-220.

王? 彬， 鄭? 偉， 宋? 莎， 等. 紫紅龍火龍果及其大果型芽變系的ISSR分析[J]. 西南農業學報， 2013， 26（4）： 1614-1617.

張冰雪， 范付華， 喬? 光， 等. 貴州地方火龍果芽變種質DNA指紋圖譜及遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 果樹學報， 2013， 30（4）： 573-577.

Cho Y G， Ishii T， Temnykh S， et al. Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice （Oryza sativa L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2000， 100（5）： 713-722.

沈? 奇， 張? 盾， 臧春鑫， 等. 基于ISSR分子標記的野生桃兒七遺傳多樣性研究[J]. 植物遺傳資源學報， 2019， 20（1）： 129-136.

楊仕美， 喬? 光， 毛永亞， 等. 基于火龍果轉錄組測序的SSR標記開發及種質親緣關系分析[J]. 分子植物育種， 2018， 16（24）： 8096-8110.

Telzur N， Abbo S， Bar-Zvi D， et al. Clone identification and genetic relationship among vine cacti from the genera Hylocereus and Selenicereus based on RAPD analysis[J]. Scientia Horticulturae， 2003， 100（1）： 279-289.

Le Bellec F， Vaillant F， Imbert E. Pitahaya （Hylocereus spp.）： a new fruit crop， a market with a future[J]. Fruits， 2006， 61（4）： 237-250.

Tel-Zur N， Abbo S， Bar-Zvi D， et al. Genetic relationships among Hylocereus and Selenicereus vine cacti （Cactaceae）： evidence from hybridization and cytological studies[J]. Annals of Botany， 2004， 94（4）： 527-534.

黃鳳珠， 陸貴鋒， 黃黎芳， 等. 火龍果種質資源收集保存與初步評價[J]. 西南農業學報， 2016， 29（4）： 920-924.

Ortiz-Hernández Y D， Livera-Mu?oz M， Carrillo-Salazar J A， et al. Agronomical， physiological， and cultural contributions of pitahaya （Hylocereus spp.） in Mexico[J]. Israel Journal of Plant Sciences， 2013， 60： 359-370.

責任編輯：黃東杰