龍眼DlZAT10基因克隆與植物超表達(dá)載體構(gòu)建

李琳 丁峰 潘介春 彭宏祥 張樹(shù)偉 何新華 徐炯志 黃幸 王金英 王穎 李浩然

摘? 要：以龍眼成熟葉片為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析得到龍眼ZAT10基因全長(zhǎng)序列，命名為DlZAT10（GenBank登陸號(hào)：MT117769），進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異引物對(duì)其開(kāi)放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析。DlZAT10基因?qū)儆贑2H2鋅指蛋白家族的C1-2i亞家族，ORF長(zhǎng)度為738 bp，編碼245個(gè)氨基酸，無(wú)內(nèi)含子，有2個(gè)典型的C2H2結(jié)合位點(diǎn)。該蛋白屬于非跨膜親水蛋白，預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核，存在40個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)。其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲，以及α-螺旋和β-折疊構(gòu)成，二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果高度一致。同源基因進(jìn)化樹(shù)分析表明，該基因與柑橘和阿月渾子親緣關(guān)系最近。同時(shí)成功構(gòu)建了植物超表達(dá)載體PBI121- DlZAT10，為DlZAT10基因功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：龍眼;DlZAT10;基因克隆;脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Using the mature leaves of longan as the materials， the full-length sequence of the ZAT10， named DlZAT10 （GenBankID： MT117769） in the longan transcriptome was obtained by transcriptome sequencing and bioinformatics analysis. Furthermore， specific primers were designed for cloning and bioinformatics analysis of the full-length sequence of its open reading frame （ORF）. DlZAT10 belonged to the C1-2i subfamily of the C2H2 zinc finger protein family. The ORF sequence was 738 bp in length， encoded 245 amino acids with two typical C2H2 binding sites of C2H2. This protein was non-transmembrane hydrophilic and predicted to be located in the nucleus with 40 amino acid phosphorylation sites. Its secondary structure was mainly composed of random coils， as well as α-helix and β-sheet. The predicted results of the secondary structure and tertiary structure were highly consistent. Phylogenetic tree analysis of the homologous gene indicated that the gene was most closely related to citrus and pistachio. At the same time， the plant overexpression vector pBI121-DlZAT10 was successfully constructed， which would provide basis for the in-depth study of the function of DlZAT10 gene.

Keywords： longan; DlZAT10; gene cloning; stress

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.005

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）屬于無(wú)患子科龍眼屬，是我國(guó)重要亞熱帶木本果樹(shù)之一，中國(guó)龍眼種植面積約占世界的59%，李時(shí)珍《本草綱目》中有“食品以荔枝為貴，而資益則龍眼為良”，其果實(shí)具有益氣、安神、滋膚之功效。但生產(chǎn)上龍眼常有“大小年”或隔年開(kāi)花結(jié)果的現(xiàn)象[1]，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益。以往生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)表明非生物脅迫（如干旱、低溫等）能促進(jìn)龍眼成花，而目前關(guān)于龍眼非生物脅迫耐受和誘導(dǎo)成花的分子機(jī)制尚未闡明。

鋅指蛋白（zinc-finger protein， ZFP）是轉(zhuǎn)錄因子的一種，因其具有指狀結(jié)構(gòu)且能結(jié)合鋅而得名[2]。根據(jù)鋅指蛋白在指狀二級(jí)結(jié)構(gòu)中與鋅離子結(jié)合的半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)量及順序的不同，可將其分為九大類(lèi)：C2H2、C8、C6、C3HC4、C2HC、C2HC5、C4、C4HC3和CCCH（C代表半胱氨酸，H代表組氨酸），其中C2H2型（Cys2 His2）是真核生物基因組中含量最多的鋅指蛋白，也是目前研究較為廣泛的一類(lèi)。Takatsuji等[3]在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)植物特有的C2H2鋅指蛋白，該轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中有176個(gè)成員，在水稻中有189個(gè)成員[4]，在煙草中有118個(gè)成員[5]，植物C2H2型鋅指蛋白具有2個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)：一是相鄰2個(gè)鋅指之間的氨基酸序列數(shù)目較多且種類(lèi)變化大;二是與DNA結(jié)合處存在一段高度保守的氨基酸序列QALGGH，該序列為植物C2H2鋅指蛋白特有[6]。

自然界的植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，常遭受干旱、鹽堿、高溫、霜凍等各種非生物脅迫，其中干旱對(duì)植物的影響在所有非生物脅迫中占據(jù)首位。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)被認(rèn)為是植物響應(yīng)和適應(yīng)脅迫條件最重要的方法之一，在此過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子起著關(guān)鍵作用，可通過(guò)調(diào)控下游脅迫響應(yīng)基因使植株體內(nèi)其它相關(guān)基因被誘導(dǎo)或抑制，從而對(duì)逆境作出反應(yīng)[7]。其中，C2H2鋅指蛋白可通過(guò)與DNA、RNA或與蛋白質(zhì)相互作用以及自身結(jié)合在植物形態(tài)發(fā)生、生長(zhǎng)發(fā)育、轉(zhuǎn)錄激活和逆境脅迫等方面發(fā)揮重要作用[8]。如C2H2 型鋅指蛋白的C1亞家族在擬南芥不同發(fā)育階段的防御及脅迫響應(yīng)中起著重要的作用。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并通過(guò)RT-PCR法從龍眼中克隆到一個(gè)C2H2型鋅指蛋白家族基因，命名為DlZAT10，以此轉(zhuǎn)錄因子為研究對(duì)象，采用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，為今后龍眼ZAT10基因的功能研究打下一定基礎(chǔ)，也為非生物脅迫促進(jìn)龍眼成花的分子調(diào)控機(jī)制研究做一定的鋪墊。

1? 材料與方法

1.1? 材料

取樣地址為廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院基地龍眼園，土壤為粘性赤紅壤土，pH 4.45～5.02，取樣樹(shù)體為長(zhǎng)勢(shì)良好并在成花期進(jìn)行干旱處理的8年生龍眼樹(shù)，選擇生長(zhǎng)良好末次梢頂端下第三張復(fù)葉的中部成熟葉作為樣品，采后用紙擦去葉片表面灰塵，迅速裝袋標(biāo)記放入液氮內(nèi)保存。

主要試劑：多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PrimeSTAR? HS DNA Polymerase、ExTaq?、rTaq?、dNTPs、DNA Marker（2000）、SolutionI、克隆載體PMD18-T、5X In-Fusion HD Enzyme Premix等均購(gòu)于TaKaRa;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)于廣西南寧國(guó)拓生物科技有限公司;植物雙元表達(dá)載體PBI121由本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶XbaI和SmaI購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;氨芐青霉素（Ampicillin）和卡那霉素（Kanamycin）購(gòu)自廣州生物工程有限公司;其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。在生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行PCR引物合成，在武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄組三代測(cè)序以及對(duì)比龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)生物信息學(xué)分析得到龍眼轉(zhuǎn)錄組DlZAT10基因序列全長(zhǎng)。

1.2? 方法

1.2.1? 龍眼葉片總RNA提取及PCR擴(kuò)增? 對(duì)研缽、研磨棒及稱量勺進(jìn)行充分消毒滅菌，取50～100 g新鮮樣品葉片加液氮充分研磨，提取龍眼葉片中的總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA的濃度和純度，記錄OD260/280、OD260/230的比值和濃度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，檢測(cè)正確后?80 ℃保存?zhèn)溆谩＠肞rimer Premier 5.0軟件根據(jù)前期得到的龍眼轉(zhuǎn)錄組DlZAT10基因序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)該基因的上下游引物（表1 c-DlZAT10），長(zhǎng)度一般為20～25 bp，選擇無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)、無(wú)引物二聚體結(jié)構(gòu)、無(wú)錯(cuò)配的引物，得到引物后以cDNA為模板通過(guò)巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因全長(zhǎng)。

1.2.2? DlZAT10基因的克隆與測(cè)序? DlZAT10基因PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰，用膠回收試劑盒回收目的基因片段，回收檢測(cè)后將目的片段與載體PMD18-T在金屬浴內(nèi)恒溫16 ℃連接12～24 h，稀釋連接液并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，搖床擴(kuò)繁后吸取菌液120 μL涂于含有氨芐青霉素（100 mg/L）的LB（Luria- Bertani）固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)15～24 h后挑選陽(yáng)性克隆菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液用通用引物MF47和MR48進(jìn)行PCR檢測(cè)，初步檢測(cè)正確的菌液送生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3? DlZAT10基因的生物信息學(xué)分析? 使用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DlZAT10進(jìn)行序列比對(duì)，使用在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量、等電點(diǎn)、親疏水性、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等;使用Mega 4.1軟件內(nèi)置的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，設(shè)置Bootstrap值為1000;使用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.4? DlZAT10基因超表達(dá)載體構(gòu)建? 對(duì)克隆測(cè)序結(jié)果正確的基因，利用In-Fusion在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)其超表達(dá)引物，分別命名為Oe-DlZAT10-F，Oe-DlZAT10-R（表1中Oe-DlZAT10），通過(guò)PCR擴(kuò)增得到超表達(dá)的DlZAT10基因目的片段，利用膠回收試劑盒回收DlZAT10基因目的片段，用5X In-Fusion HD Enzyme Premix把目的片段連接入雙酶切質(zhì)粒PBI121-GFP中（具體方法參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)擴(kuò)繁后吸取150 μL涂于添加卡那霉素（100 mg/L）的LB平板上37 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d，隨后挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)其菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)。構(gòu)建的表達(dá)載體命名為PBI121-DlZAT10。

2? 結(jié)果與分析

2.1? DlZAT10基因ORF的克隆

以龍眼cDNA為模板，用設(shè)計(jì)好的巢式克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到750 bp左右的擴(kuò)增片段，回收目的片段并與PMD18-T載體連接，菌液PCR檢測(cè)后得到750 bp左右的目的基因片段（圖1），通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)繁和測(cè)序，結(jié)果顯示DlZAT10基因ORF克隆序列與轉(zhuǎn)錄組ORF序列完全一致，該基因ORF全長(zhǎng)738 bp，共編碼245個(gè)氨基酸。

2.2? DlZAT10基因生物信息學(xué)分析

2.2.1? DlZAT10編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)與分析? 利用在線軟件ProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）預(yù)測(cè)和分析DlZAT10基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)[9]，結(jié)果顯示：該蛋白質(zhì)分子式為C1144H1778N338O362S11，原子總數(shù)為3633，分子量為26411.41 Da;由245個(gè)氨基酸組成，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為26，帶負(fù)電荷的（Asp+Glu）氨基酸殘基總數(shù)為22，理論等電點(diǎn)pI值為8.62，脂肪指數(shù)46.65，總親水性平均值（GRAVY）為?0.731，屬于親水性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)（II）為76.90，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.2.2? DlZAT10蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與分析? 通過(guò)在線軟件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)DlZAT10蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，表明該蛋白屬于C2H2超家族，在多肽鏈的中央附近存在2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。通過(guò)NCBI-BLAST工具與其他物種氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，與預(yù)測(cè)結(jié)果相同，為C2H2型鋅指蛋白。

2.2.3? DlZAT10蛋白質(zhì)信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)? 利用在線分析工具SignalSignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 4.1/）對(duì)DlZAT10蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，表明該蛋白屬于非分泌型蛋白，不經(jīng)過(guò)修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)，直接在細(xì)胞內(nèi)起作用。利用在線軟件TM- HMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)DlZAT10蛋白的跨膜螺旋區(qū)，參照結(jié)果未發(fā)現(xiàn)跨膜螺旋區(qū)，表明該蛋白為非跨膜蛋白，推測(cè)蛋白合成后不經(jīng)其他途徑轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞內(nèi)行使催化功能。用植物亞細(xì)胞定位在線分析工具PSORT II Prediction（https：//psort.hgc. jp/form2.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞核的概率為82.6%，定位于線粒體的概率為8.7%，定位于細(xì)胞骨架的概率為4.3%，定位于細(xì)胞質(zhì)的概率為4.3%，由結(jié)果推斷，DlZAT10蛋白定位于細(xì)胞核。

2.2.4? DlZAT10蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)? 利用在線預(yù)測(cè)工具NetPhos3.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）分析DlZAT10蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示：該蛋白由40個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)（閾值>0.5）構(gòu)成，包含16個(gè)蘇氨酸（Threonine）、22個(gè)絲氨酸（Serine）和2個(gè)酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點(diǎn)（圖3）。推測(cè)DlZAT10蛋白活性的調(diào)控可能與磷酸化作用有關(guān)，且在DlZAT10蛋白中發(fā)生磷酸化修飾時(shí)以絲氨酸位點(diǎn)磷酸化為主。

2.2.5? DlZAT10蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析? 利用在線分析工具PredictProtein（https：// www.predictprotein.org/）對(duì)DlZAT10蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，共占87.35%，此外α-螺旋占6.94%，β-折疊占5.71%。暴露在蛋白表面的殘基占73.06%，其他殘基占26.94%。利用SWISS-MODEL Workspace（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線工具預(yù)測(cè)DlZAT10蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成。

2.2.6? DlZAT10蛋白質(zhì)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和多重序列比對(duì)? 將DlZAT10氨基酸序列與NCBI中一致性較高的12種植物序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DlZAT10蛋白與CrZAT10（柑橘Citrus reticulata）蛋白和PvZAT10-like（阿月渾子Pistacia vera）蛋白的親緣關(guān)系較近，且和CrZAT10（柑橘Citrus reticulata）、PvZAT10（阿月渾子Pistacia vera）、ZjZAT10（棗Ziziphus jujuba）、CsZAT10（山茶Camellia sinensis）、DzZAT10（榴蓮Durio zibethinus）、HbZAT10（巴西橡膠Hevea brasiliensis）、MeZAT10（木薯Manihot esculenta）聚為一類(lèi)，推測(cè)可能在功能上也存在相似性，與AtZAT9-like（擬南芥Arabidopsis thaliana）、JrZAT10-like（核桃Juglans regia）、JcZAT10（麻楓樹(shù)Jatropha curcas）、RcZAT10（蓖麻Ricinus communis）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

利用DnaMan V6軟件進(jìn)行同源基因的多重序列比對(duì)，結(jié)果顯示該基因含有一個(gè)植物鋅指蛋白所特有且高度保守的氨基酸序列QALGGH，位于第109～114個(gè)氨基酸位置（圖5A），屬于C2H2家族轉(zhuǎn)錄因子，且包含一個(gè)大部分鋅指蛋白均具有的EAR基序（L/FDLNL/F（X）P），該基序位于蛋白質(zhì)的C端末（圖5B），具有活躍的抑制活性。

2.3? DlZAT10基因的超表達(dá)載體構(gòu)建分析

通過(guò)克隆測(cè)序鑒定，在目的基因兩端引入酶切位點(diǎn)XbaI和SmaI，導(dǎo)入PMD18-T載體，搖菌擴(kuò)繁提取質(zhì)粒，然后用XbaI和SmaI雙酶切質(zhì)粒pMD18-T DlZAT10和表達(dá)載體質(zhì)粒PBI121，分別回收目的基因和PBI121大片段，獲得具有XbaI和SmaI酶切位點(diǎn)的目的基因和pBI121-GFP載體，采用5X In-Fusion HD Enzyme Premix把目的基因片段連入到PBI121-GFP載體中。連接產(chǎn)物采用菌液PCR鑒定，所用2對(duì)引物分別為Npt II-F和Npt II-R以及35S和Oe-DlZAT10-R（NptII為pBI121質(zhì)粒抗性基因，35S為PBI121質(zhì)粒啟動(dòng)子）（表1）。35S和Oe-DlZAT10-R的菌液PCR擴(kuò)增檢測(cè)獲得750 bp左右的目的片段（圖6A），Npt II-F和Npt II-R引物的菌液PCR擴(kuò)增檢測(cè)獲得了750 bp左右的抗性基因片段（圖6B），證明目的基因已經(jīng)插入雙元表達(dá)載體PBI121-GFP中，超表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3? 討論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析得到龍眼DlZAT10基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)篩選并結(jié)合克隆技術(shù)，成功地獲得了龍眼DlZAT10基因的ORF全長(zhǎng)和超表達(dá)載體，并對(duì)其序列進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析。ZAT10蛋白屬于C2H2鋅指蛋白家族的C1-2i亞家族，也是該亞家族中研究較為廣泛的一類(lèi)蛋白，相關(guān)研究表明，ZAT10在模式植物擬南芥不同發(fā)育階段的防御及脅迫響應(yīng)中起著重要的作用[10]。

ZAT10最初被鑒定為鹽和冷響應(yīng)蛋白[11]，同時(shí)在滲透脅迫耐受性中也起著調(diào)控作用[12]。Lee等[13]通過(guò)熒光篩選法進(jìn)一步證明了ZAT10在擬南芥植物的冷響應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。通過(guò)對(duì)比龍眼ZAT10和擬南芥ZAT10蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，擬南芥ZAT10蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)于龍眼ZAT10三級(jí)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，含有更多的無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)：DlZAT10蛋白序列與PvZAT10和CrZAT10的相似度較高，分別為78.23%和72.94%，推測(cè)在功能上可能也存在相似性。

ZAT10基因的過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植物擬南芥對(duì)鹽、高溫、干旱脅迫、滲透和外源H2O2脅迫的耐受性[14-15]，研究表明龍眼花芽形成時(shí)期適當(dāng)?shù)牡蜏亍⒏珊狄约把趸让{迫可以誘導(dǎo)龍眼成花[16]。在逆境條件下，鋅指蛋白可以作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄阻遏物，參與植物對(duì)不同環(huán)境下脅迫的防御和適應(yīng)反應(yīng)[17]。ZAT10是ZAT家族中受到廣泛研究的成員之一，已被證明可由干旱、鹽堿、滲透、氧化脅迫和ABA處理等誘導(dǎo)[18-19]。進(jìn)一步推測(cè)龍眼ZAT10基因可能與龍眼抗逆及成花存在關(guān)聯(lián)。C2H2是一類(lèi)重要的植物鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，本研究已經(jīng)完成了對(duì)DlZAT10基因的克隆、序列和蛋白的分析以及超表達(dá)載體pBI121-DlZAT10的構(gòu)建，該表達(dá)載體構(gòu)建為DlZAT10基因在擬南芥或龍眼植物的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)而構(gòu)建轉(zhuǎn)基因株系提供載體基礎(chǔ)，為該基因在龍眼和其他植物中的表達(dá)及該基因功能的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

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