臍橙果酒低溫發酵工藝優化及揮發性風味物質分析

蘇 偉，鄧山鴻，陳 鋼*

（1.江西科技師范學院 生命科學學院，江西 南昌 330013；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

臍橙營養豐富，經濟價值高。隨著我國臍橙資源進一步豐盛，將臍橙加工成為豐富多樣的食品，是解決資源過剩的關鍵[1]。臍橙果酒是兼具臍橙營養物質和酒精的風味飲品，是臍橙資源深加工的重要方向之一[2]。低溫發酵是指微生物在相對較低的溫度環境中進行發酵，發酵時間延長，而發酵制品風味更佳[3]。果酒中，白葡萄酒是主要的低溫發酵產品，低溫發酵溫度一般為10～12 ℃，具有獨特的風味口感[4]。果酒采用低溫發酵有如下優點[5]：①降低雜菌微生物對果酒的影響。②較好的保留小分子香氣物質。③優化酵母代謝積累產物。研究表明，低溫發酵可促進酯類物質生產，并保持果酒中較高含量的萜烯類物質[6]。目前，果酒釀造大多以酒精含量為評價指標，在最適合酒精發酵的條件下發酵。而對果酒的開發研究，越來越注重果酒的香氣成分[7]。因此，采用低溫發酵工藝釀造臍橙果酒，提高果酒中的香氣成分含量，對改善臍橙果酒品質具有重要的意義。

該研究以臍橙為原料，通過單因素試驗和響應面試驗優化臍橙果酒低溫發酵工藝，并采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，進一步分析臍橙果酒中揮發性風味物質，為低溫發酵臍橙果酒的實際生產與應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙：江西省信豐縣；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中國微生物菌種保藏中心；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養基：青島高科園海博生物技術有限公司；果膠酶（酶活5萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；白砂糖（食品級）：鄭州瑞之祥生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：河南華興生物科技公司；3-辛醇（色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

6890N-5975B氣相色譜質譜聯用儀：美國Agilent公司；頂空進樣器：美國Supelco公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭：美國Supelco公司；MP2002電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HR1882型榨汁機：飛利浦（中國）投資有限公司；WYT-J型手持糖度計：成都光學廠；pH S22型數顯酸度計：德國Sartorius公司；MJX-100B-Z霉菌培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；VS-1300型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臍橙果酒發酵工藝流程及操作要點

臍橙→分選→清洗→去皮→破碎（加果膠酶）→壓榨→果汁（加果膠酶、SO2）→加熱→靜置→調整成分（接種酵母菌，加白砂糖、SO2）→控溫發酵→倒罐→陳釀→臍橙酒

酵母活化：將保藏的菌種接種至YPD液體培養基中活化，于28 ℃振蕩培養48 h，放入4 ℃冰箱備用。

臍橙果酒母液的制備：挑選果體偏黃色、色澤均勻、無明顯色差、表皮光滑、果形端正的臍橙，剔除霉爛果及雜質。用清水洗滌除去表面污物，以減少原料的帶菌量；將臍橙去皮切成小塊置于打漿機中破壁。在破壁后的果漿中加入果膠酶100 mg/kg，SO250 mg/kg（按偏重亞硫酸鉀質量50%計，下同），均勻靜置2.5 h后進行榨汁。果汁榨出后再加入果膠酶15 mg/kg，水浴加熱至45 ℃，靜置澄清4 h，使得果膠充分水解。

臍橙果酒的發酵：將澄清后的果汁分裝至250 mL錐形瓶中，添加白砂糖使發酵初始可溶性固形物至一定值，同時加入SO230 mg/kg。按體積比接種一定量活化釀酒酵母至含180 mL臍橙果汁的250 mL錐形瓶中。控溫發酵，至酒精度穩定不變，視為主發酵結束。發酵過程中定期排出發酵產生的CO2，主發酵結束后倒罐，轉入陳釀階段。將主發酵完成后的酒樣置于12 ℃恒溫箱陳釀30 d，得臍橙酒。

1.3.2 單因素試驗

（1）發酵溫度對臍橙果酒低溫發酵的影響：初始糖度調整至22%，接種量為果汁體積3%，分別于8 ℃、10 ℃、12 ℃、14 ℃、16 ℃、18 ℃發酵，至可溶性固形物含量不變，測定臍橙果酒的酒精度和總酯含量。

（2）初始糖度對臍橙果酒低溫發酵的影響：酵母接種量為3%，于14 ℃發酵，分別添加白砂糖使發酵母液的初始糖含量為19%、20%、21%、22%、23%、24%，至可溶性固形物含量不變，測定臍橙果酒的酒精度和總酯含量。

（3）酵母接種量對臍橙果酒低溫發酵的影響：初始糖度為22%，于14 ℃發酵。酵母接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%，至可溶性固形物含量不變，測定臍橙果酒的酒精度和總酯含量。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選取發酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）3個因素，以總酯含量（Y）為響應值，進行3因素3水平響應面試驗[8]，試驗因素與水平見表1。

表1 臍橙果酒低溫發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for navel orange wine low temperature fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

（1）酒精度、總糖、總酸等基礎理化指標的檢測參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]；可溶性固形物含量：手持糖度計測定；總酯含量測定：回流皂化法[10]。

（2）感官評定[11]：陳釀階段完成后進行感官評定。由15名食品專業人員組建感官評定小組，依據感官評分標準（見表2）對果酒進行感官評分，取平均分，滿分100分。

表2 臍橙果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of navel orange wine

1.3.5 香氣成分檢測

頂空-固相微萃取（HS-SPME）[12]：取8 mL臍橙酒樣品、3.0 g NaCl于20 mL樣品瓶中，密封，將樣品瓶于40 ℃攪拌平衡15 min后，將老化的萃取頭插入密封的樣品瓶中，頂空萃取40 min，然后在氣相色譜進樣口230 ℃解吸3 min，采用GC-MS分析其揮發性成分。

GC條件：石英毛細管色譜柱HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；起始溫度40 ℃，保留時間2 min，以5 ℃/min升至230℃，保留時間15min；不分流進樣，載氣He，流速：1.2mL/min。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，進樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質量范圍33～400 amu。

定性與定量分析：與Wiley7.0/美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）05檢索數據庫進行匹配，并結合保留指數進行定性分析。采用峰面積歸一化法計算各物質的相對含量。

1.3.6 數據分析

數據采用SPSS18.0進行統計分析，Design-Expert V8.0.6進行響應面試驗，Origin2018作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 發酵溫度對臍橙果酒發酵的影響

圖1 發酵溫度對臍橙果酒酒精度和總酯含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content and total ester content of navel orange wine

由圖1可知，隨發酵溫度的增加，酒精度呈現逐漸上升的趨勢，而總酯含量呈現先增加后緩慢下降的趨勢。當臍橙果酒發酵溫度為14 ℃，總酯含量達到最大值（1.081 g/L）。發酵溫度過低時，會導致發酵遲滯或停止[13]，嚴重影響發酵效果，酒精度和總酯含量偏低。發酵溫度偏高則不利于小分子的保留，使果酒總酯含量略低。綜合考慮，發酵溫度為14 ℃較合適。

2.1.2 初始糖度對臍橙果酒發酵的影響

圖2 初始糖度對臍橙果酒酒精度和總酯含量的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on alcohol content and total ester content of navel orange wine

由圖2可知，隨初始糖度的增加，酒精度和總酯含量呈現先上升后下降的趨勢，在初始糖度為22%時達到最大值（1.128 g/L）。發酵母液中的糖是酵母代謝產生酒精和風味物質的主要消耗物，母液中的糖含量過低，則果酒無法達到預期的酒精度，口味寡淡。發酵母液中的糖含量過高，則會使酵母處于高滲環境中，抑制酵母的發酵效率，果酒口感也會變差[14]。綜合考慮，初始糖度為22%較合適。

2.1.3 接種量對臍橙果酒發酵的影響

圖3 酵母接種量對臍橙果酒酒精度和總酯含量的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on alcohol content and total ester content of navel orange wine

由圖3可知，臍橙果酒的酒精度與總酯含量隨酵母接種量的增加呈現先增大后減小的趨勢，在接種量為3%時達到最大值（1.080 g/L），果酒的發酵接種量的大小受到菌種和發酵母液的環境的限制，直接影響到果酒的發酵效率[15]。低溫發酵時接種量過小，則啟動發酵較慢，發酵效率低。接種量過高則會導致營養物質消耗量過大，不利于酒精和酯類物質的生產。綜合考慮，選擇接種量為3%較合適。

2.2 響應面試驗結果分析

在單因素試驗基礎上，確定發酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）為考察因素，以總酯含量（Y）為響應值，由Design-Expert V8.0.6統計分析軟件設計3因素3水平Box-Behnken響應面試驗，響應面分析結果見表3，方差分析見表4。通過軟件分析擬合，得到臍橙低溫發酵果酒總酯含量對發酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）的回歸方程為：Y=1.074+0.020A+0.052B+0.024C-0.03AB-0.049AC+0.03BC-0.11A2-0.09B2-0.07C2。

表3 臍橙果酒低溫發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for navel orangewinelowtemperaturefermentationconditionsoptimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），回歸模型的決定系數R2=0.985 4，調整決定系數R2Adj=0.966 6，說明該回歸模型與試驗擬合較好，可以用于對低溫發酵臍橙酒總酯含量的預測。其中B、C、AC、A2、B2、C2對果酒總酯含量影響極顯著（P＜0.01）；A、AB、BC對結果影響顯著（P＜0.05）。由方差分析說明試驗所選因素的影響強弱次序為初始糖度＞酵母接種量＞發酵溫度。

由響應面分析得到低溫發酵臍橙酒的最佳條件為發酵溫度13.98 ℃，初始糖度22.33%，酵母接種量3.24%，理論預測總酯含量為1.086 g/L。考慮實際因素及操作條件，將低溫發酵臍橙酒的工藝參數調整為發酵溫度14 ℃、初始糖度22.3%、酵母接種量3.2%，據此工藝條件的低溫發酵試驗，經3次驗證試驗得到果酒的平均總酯含量實際值為1.084 g/L，與預測值接近，說明模型可行性較高，可作為實際生產的依據。

圖4 初始糖度、發酵溫度、酵母接種量交互作用對總酯含量影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial sugar content,fermentation temperature and yeast inoculum on total ester content

2.3 臍橙低溫發酵酒理化指標及香氣成分分析

表5 低溫發酵臍橙果酒基本理化指標Table 5 Basic physicochemical indexes of low temperature fermented navel orange wine

由表5可知，臍橙果酒各項理化指標符合國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》標準。

對低溫發酵臍橙果酒的香氣成分進行的定性與定量分析結果（見表6）可知，臍橙果酒共鑒定出33種香氣化合物，含量占總成分的97.91%，其中醇類物質6種（17.09%），萜烯類物質10種（27.65%），酸類物質2種（8.03%），酯類物質10種（43.24%），醛酮類物質5種（1.91%）。香氣成分分析結果表明，酸類和醛酮類物質整體較少，萜烯類、酯類和醇類物質相對含量較高。低溫發酵的相關研究表明，低溫環境為萜烯類和酯類物質提供了較好保留環境[16]。與此同時，酵母處于低溫脅迫狀態時，也會減少高級醇含量，并使酯類物質產量增加[17]。

在萜烯類物質中含量相對較高的有D-檸檬烯（14.70%）、β-水芹烯（5.38%）、4-萜烯醇（3.52%），這些物質主要是臍橙的原果香氣，賦予果酒獨特的臍橙風味與口感[18]。尤其是D-檸檬烯，在果酒中含量高，香氣閾值低，對果酒香氣貢獻較大，此外，研究還發現其具有獨特的保健功能[19]；酯類物質含量相對較高的有辛酸乙酯（10.68%）、癸酸乙酯（8.87%）、庚酸乙酯（7.77%），這些物質對于果酒的花香、果香具有較大的貢獻[20]，在低溫發酵時產量較高。

醇類物質與酸類物質含量均與酵母低溫發酵代謝有關，低溫發酵會使高級醇含量減少，而癸酸和辛酸是酵母低溫發酵典型的代謝產物，與酵母的低溫適應性有關。醛酮類物質整體含量較低，對果酒的影響較小。

表6 低溫發酵臍橙果酒香氣成分分析Table 6 Analysis of aroma components in low temperature fermented navel orange wine

3 結論

本研究通過單因素及響應面試驗優化臍橙果酒低溫發酵工藝，最佳發酵條件為發酵溫度14 ℃、初始糖度22.3%、酵母接種量3.2%。在此最佳發酵條件下，釀造的臍橙果酒總酯含量為1.084 g/L。此工藝釀制的臍橙果酒外觀澄清、透明，果香酒香濃郁協調，具有獨特的風味。通過頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術對臍橙酒風味物質進行分析鑒定，在低溫發酵臍橙酒中共檢出揮發性風味物質32種，其中含量較高的為萜烯類物質（28%）和酯類物質（43%），兩類物質對于果酒的香氣具有重要貢獻。試驗對豐富臍橙果酒香氣成分，改善臍橙果酒品質具有重要意義。