響應面法優化黑曲霉SH312-26-19產果膠酶發酵條件

武佳文，郝 林*，郭佳垚，李倩倩，趙廉謙

（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801）

果膠酶是指降解果膠質的一類酶的總稱，根據其作用機理可分為3大類：聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠酯酶（pectinestease，PE）、果膠裂解酶（pectinlyases，PL）[1-2]不同來源的果膠酶與果膠多糖的作用方式不同，其分解產物比例不同[3-6]。PG專一性地分解果膠質中兩個非酯化半乳糖醛酸間的糖苷鍵，使果膠很快從大分子降解為分子質量較小的低聚糖類，能很快降低果膠溶液的黏度；PL通過反式消去作用生成半乳糖醛酸；PE具有脫脂作用可水解甲酯化果膠半乳糖醛酸骨架C-6位的甲氧基，該過程通常沿果膠多糖鏈線性進行，稱為“單鏈機制”，生成果膠酸和甲醇[7-8]。

果膠酶主要用于提高果蔬汁出汁率和果酒澄清處理，增加產品風味[9]，但在以果膠含量高的水果作為原料時，果酒在釀造過程中果膠由于果膠酶中甲酯酶的分解反應，會使甲氧基基團增加而導致甲醇過量。甲醇可在人體內被乙醇脫氫酶代謝成甲醛或者甲酸，從而造成代謝性酸中毒[10-13]。

本試驗優化黑曲霉生產果膠酶的發酵條件，旨在降低酶解液中甲醇生成量，并對比果膠酶粗酶液與市售果膠酶的甲醇生成量，以期為果膠酶的工業化應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養基

黑曲霉（Aspergillus niger）SH312-26-19：本課題組前期分離篩選并經紫外線誘變得到產生較高活力的聚半乳糖醛酸酶的黑曲霉菌株[14]。

固體發酵培養基[15]：麩皮10 g，H2O 15 mL，初始pH自然。121 ℃、0.1MPa滅菌20min。

1.1.2 主要試劑

麩皮、豆粕粉、陳皮粉、馬鈴薯：市售；果膠酶1（60 000 U/g）：浙江一諾生物科技有限公司；果膠酶2（40 U/mg），D-半乳糖醛酸：北京索萊寶科技有限公司；其他藥品均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

V-1300型可見分光光度計：上海美析儀器有限公司；YQX-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DHP-9032型電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；BJ-CD型超凈工作臺：上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養

無菌水洗下斜面上的孢子，在裝有玻璃珠的三角瓶振蕩制成孢子懸液。通過血球計數板將孢子懸液的孢子數調整至106個/mL。定量的孢子懸液接種至固體發酵培養基中，30 ℃靜置培養3 d。

1.3.2 粗酶液的制備

稱取1 g麩曲加入100 mL蒸餾水中，30 ℃、200 r/min搖床振蕩10 min，3 000×g條件下離心10 min即得粗酶液。

1.3.3 單因素試驗

分別對碳源比例（麩皮∶玉米粉=0∶5、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、5∶0），麩皮添加量（6 g、8 g、10 g、12 g、14 g），氮源種類（（NH4）2HPO4、（NH4）2SO4、豆粕粉、NH4Cl、（NH4）2C2O4），（NH4）2SO4添加量（0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g、1.4 g），接種量（6%、8%、10%、12%），發酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃），發酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d），誘導物（陳皮粉）添加量（0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g）和初始pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）進行單因素試驗。

1.3.4 Plackett-Burman（PB）試驗設計

分別選取以上7個因素的高低2個水平，通過Minitab18軟件選用Factors=7，Runs=12的PB設計，以果膠酶活力（Y）作為響應值。通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對酶活力影響較為顯著的因素。

1.3.5 最陡爬坡試驗

根據PB試驗及其分析結果設計最陡爬坡試驗，對顯著因素進行梯度設計，其余不顯著的因素在PB分析結果中是正效應的取高水平，是負效應的選低水平。

1.3.6 Box-Behnken試驗設計[16]

用Box-Behnken試驗設計進行響應面試驗，通過試驗數據擬合響應面模型，得到二次多項式，并最終確定最佳發酵條件。

1.3.7 測定方法

果膠酶活力測定：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[17]。果膠酶酶活定義為1 mL粗酶液，每分鐘分解果膠生成1 μmoLD-半乳糖醛酸，所需酶量為1個酶活單位（U/mL）。

甲醇含量的測定：分別將粗酶液與市售果膠酶酶活調整為50 U/mL，并與5%果膠溶液在50 ℃酶解3 h、4 h、5 h后，參照GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》[18]中的方法測定反應體系中甲醇含量。

1.3.8 統計分析

所有試驗做3個平行，2個重復，使用Excel 2016統計試驗數據。采用Minitab18、Design-Expert 8.0.6和Sigmaplot 10.0軟件進行數據分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗篩選結果

圖1 各發酵因素對果膠酶活的影響Fig.1 Effect of each fermentation factors on the activities of pectinase

由圖1a、1b可知，麩皮與玉米粉的比例為5∶0時，果膠酶活最高（P＜0.05），為1 277.82 U/mL，且黑曲霉產果膠酶的活力隨著麩皮的比例的增加呈先降低后升高的趨勢，麩皮添加量為10 g時果膠酶活力最高。麩皮疏松多孔，有利于黑曲霉充分利用氧氣，在麩皮與玉米粉的體系中，玉米粉占有這部分空隙，導致能被黑曲霉利用的氧氣減少，黑曲霉呼吸作用減弱，酶活降低。發酵期間無機氮源可以控制發酵過程中菌體生長時期和代謝產物形成時期的協調[19-20]。由圖1c、1d可知，在氮源為（NH4）2SO4的培養基中，黑曲霉產果膠酶的活力最高，且（NH4）2SO4添加量為1.0 g時，果膠酶活力達到1 360.67 U/mL。由圖1e可知，隨著黑曲霉接種量的提高，果膠酶活先升高，后降低，接種量為10%時，酶活最大，為1 426.85 U/mL。接種量增加，黑曲霉充分利用培養基中營養成分，生長繁殖，酶的合成和分泌量增加；但接種量過高時，營養消耗過快，在有限的營養成分中，菌種老化速度也將加快，最終酶的合成和分泌量也會減少。陳皮粉中的果膠在培養基中可作為誘導物誘導果膠酶的合成，果膠降解的中間產物或代謝產物是有效的誘導物。菌體在發酵過程中會產生一定量的PG，釋放到細胞外，將陳皮粉中的果膠分解成具有一定分子量的降解物而被細胞吸收，并在不導致降解物阻遏條件下，直接或間接地誘導菌體，大量合成果膠。由圖1f可知，陳皮粉添加量為0.5～2.0 g時，酶活逐漸升高，添加量為2.0 g時，達到最高，為2 086.37 U/mL，當添加量＞2.0 g時，酶活下降。這可能是因為在陳皮粉添加達到一定量時，陳皮粉中含有的陳皮甙對菌體產酶的抑制作用越加明顯，從而使產酶量下降[21]。由圖1g可知，發酵溫度為30 ℃，酶活最高，為2 286.13 U/mL，顯著高于其他溫度時的酶活（P＜0.05）。由圖1h可知，發酵前期，果膠酶隨著發酵時間的延長逐漸積累，到第4天達到最高值，為2 341.62 U/mL，在發酵后期，發酵體系中營養物質消耗，有害代謝產物積累，體系中酶的生成速度變慢，部分酶可能失活，酶活呈下降趨勢。由圖1i可知，隨著初始pH值的增大，酶活呈先增加后降低的趨勢，初始pH值為3時，酶活達到最高，為3 010.65 U/mL。

2.2 PB試驗設計及優化

Plackett-Burman試驗設計及結果見表1，其統計分析結果見表2。由表1和表2可知，發酵溫度（P=0.002）、麩皮添加量（P=0.013）、發酵時間（P=0.037）對果膠酶活呈正效應均呈顯著正效應，作為主要影響因素進行最陡爬坡試驗和響應面設計。其他因素正效應取高水平，負效應取低水平。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Design and results of Plackett-Burman tests

表2 Plackett-Burman試驗結果對果膠酶活影響的統計分析Table 2 Statistical analysis of effect of Plackett-Burman tests results on the activity of pectinase

2.3 最陡爬坡試驗

麩皮添加量、發酵時間、發酵溫度均呈顯著正效應，應增加，最陡爬坡試驗結果見表3。由表3可知，果膠酶活在第二組達到最大值（2 388.25 U/mL）。因此，以第二組作為響應面試驗的中心點。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table 3 Design and results of the steepest ascent tests

2.4 Box-Behnken設計及結果

2.4.1 構建數學模型及模型檢驗

根據Plackett-Burman試驗及最陡爬坡試驗結果，以麩皮添加量（X1）、發酵時間（X2）、發酵溫度（X3）為3個自變量，每個因素設置3個水平，果膠酶酶活（Y）為響應值，設計Box-Behnken響應面試驗，Box-Behnken響應面試驗因素編碼、水平及結果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計的因素、水平及結果Table 4 Factors,levels and results of Box-Behnken tests design

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表4分析，構建數學模型。通過對該模型進行方差分析，可得回歸模型方差分析見表5。得到3個因素多元線性回歸方程為：Y=2 468.76+264.91X1+166.93X2+192.08X3-180.98X1X2-106.22X1X3+196.82X2X3-217.04X12-571.64X22-640.97X32。對該模型進行顯著性檢驗，二次回歸模型顯著（P=0.000 2＜0.05），失擬項不顯著（P=0.971 5＞0.05），說明模型與試驗擬合良好。能較好地反映發酵過程中三種因素與果膠酶活（Y）之間的準確關系，利用回歸方程得出最佳的發酵條件。模型的決定系數R2=96.85%，調整決定系數R2Adj=92.80%，表明模型與試驗值擬合性良好，試驗誤差較小，各因素與果膠酶活性之間有高度相關性，可對果膠酶的活性進行準確預測和分析。各因素對黑曲霉果膠酶活的影響次序為X1＞X3＞X2。除交互項X1X3外，其余的變量對Y都有顯著影響。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

續表

2.4.2 響應面曲面圖

圖2 麩皮添加量、發酵時間、發酵溫度交互作用對果膠酶活影響的響應面曲面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between bran addition,fermentation time and temperature on the activity of pectinase

由圖2可知，X1X2，X2X3有明顯的交互作用，特別是X2X3交互作用較顯著，響應面曲線走勢較陡，有明顯的最高點。

2.4.3 模型驗證

利用Design-Expert 8.0.6分析得出該菌株產果膠酶的最佳發酵條件：培養基添加麩皮添加量11.1 g，發酵時間為4.08 d，發酵溫度為30.58 ℃，此方程預測的最大酶活可達到2 559.25 U/mL。為了操作方便，修正發酵參數為：麩皮添加量11.0 g，發酵時間為4 d，發酵溫度為30 ℃。在最佳培養條件下進行了3 次重復實驗，所測酶活實際值為（2 518.69±19.34）U/mL，實際值與預測值擬合度為98.41%，證實該模型有效可靠。

2.5 發酵粗酶液與市售果膠酶酶解產物中甲醇生成量的對比試驗

圖3 粗酶液與市售果膠酶甲醇生成量的比較Fig.3 Comparison of methanol production between crude enzyme solution and commercial pectinase

由圖3可知，在相同條件下進行酶促反應的第3、4、5小時時兩種市售果膠酶甲醇的生成量均高于粗酶液，在酶解第4 h時，粗酶液的酶解體系中甲醇的生成量分別比市售果膠酶1和市售果膠酶2體系中低17.9%和12.8%，說明該菌株發酵生產的果膠酶在酶促反應過程中甲醇生成量較低，可應用于果膠含量較高的水果為原料的果酒生產。

3 結論

對黑曲霉SH312-26-19產果膠酶的發酵條件進行了優化。結果表明，產果膠酶的最佳發酵條件：培養基組成為11 g麩皮，H2O 15 mL，（NH4）2SO41.0 g，陳皮粉2.0 g，初始pH值為3；發酵時間為4 d，發酵溫度為30℃。在此優化發酵條件下，所得的果膠酶活力為（2 518.69±19.34）U/mL，與預測值幾乎吻合。粗酶液在酶促反應體系中甲醇生成量分別比市售果膠酶1和果膠酶2低17.9%和12.8%。

以上研究為黑曲霉SH312-26-19產果膠酶的機理、酶學性質研究及在果汁、果酒中的應用奠定了基礎。