一株高效降解乳酸的原玻璃蠅節桿菌篩選與代謝動力學分析

羅青春，喬宗偉，2，鄭 佳，2 *，張 霞，雷學俊，施 思，劉多濤

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644007；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644007）

濃香型白酒是我國傳統白酒中的典型代表之一，其品質及風格由各種風味物質的量比關系決定[1]，優質濃香型白酒中，四大酯類的比例為己酸乙酯＞乳酸乙酯＞乙酸乙酯＞丁酸乙酯[2-3]。乳酸乙酯含量過高，使得酒體發澀、主體香差，嚴重影響酒的品質。糟醅發酵過程中乳酸含量過高，易與窖池內鈣、鐵離子反應，形成乳酸鈣、乳酸鐵和乳酸亞鐵，從而導致窖泥板結老化，嚴重影響窖泥微生物的正常代謝[4-6]。因此“降乳”是濃香型白酒生產企業迫切解決的問題之一。

目前研究中，“降乳”的主要方法有：添加抑制劑或輔酶，如富馬酸可抑制乳酸菌的生長[7]；控制優化生產工藝，如適當控制入窖淀粉的含量、降低入窖溫度、控制用曲量等；添加乳酸降解菌，其中添加乳酸降解菌操作簡單，還可以生成乙酸、丙酸、丁酸等香氣前體物質[8]，從而合成多種酯類物質來增加白酒中的香氣成分。因而從釀酒體系中篩選出具有乳酸降解能力的野生微生物菌株對優化白酒指標、改善窖泥理化狀態不失為一種較為合理的途徑。自然界里能夠利用乳酸作為碳源的微生物很多，在已有報道中，分離到的乳酸降解菌主要有丙酸桿菌屬、醋桿菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、脫硫弧菌屬等多個屬的一些種的某些菌株[9-10]。窖泥是傳統固態法白酒發酵的基礎，窖泥中含有數量龐大、種類復雜的微生物菌群，部分微生物在發酵過程中進入白酒糟醅中繁殖和代謝，產生復雜多樣的代謝產物，形成種類豐富的風味物質，形成白酒風格和品質[11-13]。近年來，窖泥微生物菌群的研究表明，窖泥的優勢微生物菌群包括：八疊球菌屬（Sporobacter）、紅蝽桿菌屬（Coriobacterium）、梭菌屬（Clostridium）、纖維素單胞菌屬（Cellulomonas）、Sediminibacter、氨基桿菌屬（Aminobacter）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、Sporosarcina、醋桿菌屬（Acetobacter）、互營菌屬（Syntrophus）等[14-15]。同時，已有研究團隊從窖泥中篩選出具有乳酸降解能力的菌株，如Clostridium、Terrisporobacter、芽孢桿菌屬（Bacillus）、泥桿菌屬（Ilyobacter）、脫硫腸狀菌屬（Desulfotomaculum）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和拉烏爾菌屬（Raoultella）等[10]。

本研究試圖從窖泥中篩選出一株乳酸降解菌，以期對濃香型白酒“降乳”提供了一種新的菌株，豐富對窖池稀缺微生物資源的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

樣品取自宜賓五糧液股份有限公司窖齡為20年窖池的窖底泥，窖池分別在窖底4個角落和接近中心點的一點各取一個樣，每個樣品質量約100 g，在無菌袋中混勻后立即使用。

1.1.2 培養基

富集培養基：NaCl 1 g、K2HPO41 g、NH4Cl 1 g、MgCl20.5 g、NaNO31 g、葡萄糖2 g，溶于500 mL蒸餾水中，酒糟20 g、黃水10 mL、曲粉6 g、酒尾20 mL，溶于500 mL蒸餾水中攪動0.5 h后用8層紗布過濾，再混合后用NaOH調節pH至6.5～7.0。

無機鹽培養基：MgSO40.5 g、KH2PO41 g、NH4Cl 1 g、6.67 g/L CaCl23 mL、17 g/L FeCl33 mL、FeSO4·7H2O 0.05 g、NaNO31 g、不同濃度乳酸（唯一碳源）、1 000 mL蒸餾水。

保藏培養基：LB培養基[16]。

1.2 儀器與設備

5810高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；BX41生物顯微鏡：日本Olympus公司；inoLabpH740 pH計：德國WTW公司；LRH生化培養箱、THZ-98C恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司；Ezup柱式細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒（SK8255）：上海生工生物有限公司；API Coryne棒狀桿菌鑒定試劑盒：法國生物梅里埃公司；乳酸（色譜純）：比利時Acros Organics公司；乙醇（色譜純）：美國HoneyWell公司；4-辛醇（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；頂空固相微萃取裝置（CAR/DVB/PDMS纖維萃取，50 μm，1 cm長）：美國Supelco公司；PAL RTC2多功能樣品前處理平臺（帶有SPME模塊）：瑞士CTC公司；7890B GC-5977B MSD氣相色譜-質譜聯用儀、1100系列高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司；高效液相色譜色譜柱Venusil ASB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國Agela公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸降解菌的篩選

（1）富集培養

將窖泥樣品以4%的接種量接種于含4 g/L乳酸的富集培養基，30 ℃靜置培養15 d。

（2）初篩

將富集培養液進行梯度稀釋，取0.1 mL 10-6稀釋液涂布于無機鹽培養基平板，30 ℃培養3 d，挑取單菌落在新的無機鹽平板上劃線純化。

（3）復篩

方法同上，將上述篩選的菌株接種于無機鹽培養基，培養15 d后，取發酵液進行乳酸含量測定。

（4）乳酸測定

取上述發酵液0.1mL，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1mL，于2 mL離心管中，振蕩均勻，0.2 μm濾膜過濾后作為待測樣品。

利用HPLC法測定發酵液中乳酸的含量。色譜條件為柱溫30 ℃；流動相A為甲醇，B為0.1%磷酸水溶液。梯度洗脫程序為0 min：100%B；8 min：100%B；25 min：10%B；28.5 min：10%B；29 min：100%B；35 min：100%B；停止：35 min；流速：1.0 mL/min。檢測波長：214.8 nm。

1.3.2 乳酸降解菌的鑒定

（1）形態觀察實驗

形態觀察包括菌落形態、革蘭氏染色觀察[17]。

（2）生理生化特性

生理生化利用API Coryne棒狀桿菌鑒定試劑盒進行鑒定。

（3）分子生物學鑒定

DNA提取：將篩選的降解效果最好的菌株接入保藏培養基中，30 ℃培養15 d，取1 mL菌液10 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體，按細菌基因組DNA抽提試劑盒（B518225）提取DNA，-20 ℃保藏備用。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增：利用引物27F和1492R對細菌基因組16S rRNA進行擴增，27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增體系（25 μL）：10×PCR buffer 2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5mmol/L）1μL，DNA10ng，引物F（10 μmol/L）0.5 μL，引物R（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。擴增程序：94 ℃、4 min；94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、60 s，共30個循環；72 ℃10 min，4 ℃終止反應。

16S rRNA序列測定：利用膠回收試劑盒進行PCR擴增產物的純化；純化產物的測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

系統發育樹構建：將所測定的細菌16S rRNA基因序列分別與GenBank數據庫進行BLASTn和RDP Classifier相似性分析，選取與實驗菌株親緣關系相對較近的標準菌株用Clustalw軟件進行序列比對，采用MEGA5軟件進行系統發育分析，構建系統發育樹，采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法，Bootstrap驗證次數為1 000。

序列提交到NCBI Genbank，獲得登錄號為MH256112。

1.3.3 乳酸降解菌的生長動力學

將菌株WLY-B-L2種子液按5.0%（V/V）的接種量分別接種到LB培養液中（pH7.0），30 ℃、120 r/min培養，于不同時間取菌液測吸光度值（OD600nm值）。每個樣品均重復3次，取平均值。

采用Logistic方程描述菌體生長動力學模型。在此方程中比生長速率與尚未利用的負載能力相關聯，即生長期細胞的增長速率可以用下式表達[18]。

當t=t0時，X=X0時，將上式積分得到下式。

式中：X為菌體濃度（OD600nm值）；t為培養時間，h；um為最大比生長速率，h-1；X0為初始菌體濃度（OD600nm值）；Xm為最大菌體濃度（OD600nm值）。

1.3.4 乳酸降解菌的降解動力學

將菌株WLY-B-L2種子液按5.0%（V/V）的接種量分別接種到含2g/L、4g/L、6g/L、8g/L乳酸的LB培養液中（pH 7.0），30 ℃、120 r/min培養，于不同時間取菌液，測乳酸殘留量，對照試驗接入同體積無菌水作空白對照。每個樣品均重復3次，取平均值。

對于乳酸降解動力學模型，采用一級動力學模型[19]：

式中：b為常數；c為底物濃度，g/L；k為一級降解速率常數；t為降解時間，h。

2 結果與分析

2.1 乳酸降解菌株的分離篩選

乳酸質量濃度分別為1 g/L、2 g/L和4 g/L的無機鹽培養基平板均能生長出菌落。從乳酸質量濃度為4 g/L無機鹽培養基平板上挑取10株菌，在30 ℃靜置培養15 d，菌液經液相色譜測定后，篩選出了降解效果最好的菌株WLY-B-L2，其乳酸降解率為16.9%（空白組乳酸含量為4.08 g/L，試驗組乳酸含量為3.39 g/L）。

2.2 菌株WLY-B-L2的鑒定

2.2.1 形態觀察結果

圖1 菌株WLY-B-L2的顯微（a）及菌落（b）形態Fig.1 Microscope (a) and colony (b) morphology of strain WLY-B-L2

由圖1a可知，菌株WLY-B-L2的細胞革蘭氏染色呈陽性，桿狀；由圖1b可知，菌落呈白色、表面光滑濕潤、中間凸起、邊緣整齊。

2.2.2 生理生化特性

由表1可知，WLY-B-L2能利用硝酸鉀、吡嗪酰胺、2-萘基磷酸、2-奈基-α-D-吡喃糖苷、明膠（牛源）。不能利用吡咯烷酮-2-奈胺、萘酚-ASB1-β-D-葡萄糖醛酸鹽、2-奈基-β-D-半乳糖苷、1-奈基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、七葉靈檸檬酸鐵、尿素、葡萄糖、核糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖（牛源）、蔗糖、糖原。過氧化氫試驗結果呈陽性。

表1 菌株WLY-B-L2的生理生化試驗結果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments of strain WLY-B-L2

2.2.3 分子生物學鑒定

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株WLY-B-L2的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain WLY-B-L2 based 16S rDNA gene sequences

將菌株16SrRNA基因序列與GenBank上的其他16SrRNA基因序列進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析，構建系統發育樹結果見圖2。由圖2可知，菌株WLY-B-L2與Arthrobacter protophormiaestrain DSM 20168（NR_026195）相似性為99.9%，結合生理生化特性、形態特征將該菌鑒定為放線菌目下的原玻璃蠅節桿菌（Arthrobacter protophormiae）。經RDP進行分類，其分類地位為：放線菌綱（Actinobacteria）放線菌目（Actinomycetales）微球菌科（Micrococcaceae）節細菌屬（Arthrobacter）。

2.3 降解菌WLY-B-L2的生長曲線

在LB培養基中接種WLY-B-L2，測定其菌體在不同培養時間的OD600nm值，利用SPSS 22.0軟件對菌株生物量實測值與菌體生長動力學模型進行非線性擬合，如圖3所示，得到um=0.219 h-1，X0=0.622，Xm=2.318，代入方程（1）和（2）后得到菌株生長動力學方程：

X=0.622e0.219t/[1-0.268（1-e0.219t）]

其中，R2=0.971。

圖3 菌株WLY-B-L2的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain WLY-B-L2

2.4 降解菌WLY-B-L乳酸降解生長曲線

圖4 不同培養時間的乳酸殘留量Fig.4 Residual concentration of lactic acid in different cultivation time

由圖4可知，菌株WLY-B-L2具有較強的降解乳酸的功能，不同質量濃度下經過80 h后乳酸均未檢測到。

進一步采用一級動力學模型對圖4數據進行降解方程構建，結果如表2所示，三種不同質量濃度下的降解方程分別為c=3.00-0.037 50t、c=6.01-0.083 75t、c=9.03-0.066 25t。

表2 不同質量濃度乳酸下菌株WLY-B-L2的乳酸降解方程Table 2 Lactic acid degrading equations of strain WLY-B-L2 under different concentrations of lactic acid

3 討論

過去研究表明大多數放線菌能產生生物活性物質，如抗生素、有機酸、氨基酸、微生物甾體酶及酶抑制劑、免疫調節劑等[20-22]；有些放線菌還能降解大量的各種有機物，從而參與自然界物質循環、凈化環境、改良土壤[23-24]。然而，目前關于濃香型白酒窖泥放線菌的報道還較少，至今還未見有關濃香型白酒節細菌屬（Arthrobacter）的相關報道。劉茂柯等[25]利用PCR-變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）研究了窖泥放線菌群落結構和多樣性，表明窖泥放線菌歸于Olsenella，Atopobium，Streptomyces和Corynebacterium四個屬，Olsenella，Atopobium優勢度隨窖齡延長而升高。裴樂樂等[26]利用熒光定量PCR研究了不同窖齡窖泥放線菌，發現隨著窖齡的增加，放線菌數量隨之增加。此外，王濤等[27]從窖泥中分離到的Streptomyces屬的多株放線菌可產酯、酸、醛、酮和醇類等濃香型白酒中的重要呈香呈味物質。

本研究中首次從窖泥中篩選出能降解乳酸的放線菌，在乳酸最大初始質量濃度為9 g/L的培養基體系中發酵80 h后乳酸降解率達100%，降解效果較為理想。鄧漢森等[28]從濃香型白酒糟醅中篩選出一株可以降解乳酸的酵母菌。隨后，栗連會[10]也從酒醅中篩選分離到歸屬于Clostridium，Terrisporobacter，Bacillus，Ilyobacter，Desulfotomaculum，Staphylococcus和Raoultella等7個屬的17種乳酸降解菌，I.delafieldii的降解效果最佳，降解率為100%，同時C.cochlearium，C.tyrobutyricum和C.roseum的降乳效率也超過50%，分別達到了94.1%，67.6%，55.9%。而S.epidermidis，R.ornithinolytica，B.amyloliquefaciens和B.amyloliquefaciens的降乳效率均低于25%，降乳效果較差。

4 結論

本研究從濃香型窖泥中篩選出了一株乳酸降解菌，經多重鑒定，菌株WLY-B-L2為原玻璃蠅節桿菌（Arthrobacter protophormiae），系國內首次分離到了降解乳酸的放線菌。其生長、降解過程分別符合Logistic生長動力學（um=0.219 h-1，Xm=2.318）和一級降解動力學模型，當乳酸初始質量濃度為3 g/L、6 g/L和9 g/L時，WLY-B-L2完全降解乳酸的時間分別為40 h、72 h和80 h。放線菌是窖泥中棲息的功能微生物菌群之一，并且對乳酸具有顯著的降解作用，豐富了對放線菌在窖泥中功能的認識。