高濃麥汁中添加紅棗汁對酵母發酵性能及啤酒風味的影響

張曉榮，廖劍橋，雷宏杰*

（西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

在我國，啤酒行業存在生產成本高、產品種類單一、缺乏特色與創新等問題[1]，在保證產品質量的情況下降低生產成本以保證效益，同時推出更多風格的產品，加大市場競爭力，是啤酒企業亟需解決的問題。啤酒高濃釀造技術（指用15°P以上的麥汁釀造啤酒的工藝）具有諸多優點，它可減少生產成本、降低能源消耗、縮短生產周期[2-4]。同時，高濃釀造技術還有助于提高啤酒的非生物穩定性，促使冷渾濁蛋白的沉淀，對啤酒風味具有改善作用，發酵后的高酒精度有利于抑制雜菌生長，提高單位浸出物的酒精產率等[5]。此外，由于其獨特的釀造工藝，已被廣泛應用于淡爽型啤酒的釀造[6-7]。

然而，啤酒高濃釀造技術存在一些弊端[8]：延長了啤酒發酵時間，酵母的活力與存活率下降；啤酒風味穩定性變差，高濃釀造的啤酒與常濃釀造的啤酒風味存在差異，采用該技術常導致啤酒醇酯不協調；啤酒泡沫穩定性變差，啤酒的泡持性降低；酒花利用率降低。此外，酵母細胞在高濃釀造過程中往往面臨更嚴峻的環境脅迫，主要來自兩方面[9]：一方面，發酵初期更高的麥汁濃度導致麥汁體系滲透壓更高，不利于酵母的生長；另一方面，發酵結束時乙醇濃度更高，導致細胞面臨更強的毒性，致使酵母存活率下降，活細胞數減少，不利于酵母的重復使用。酵母可調控自身代謝以適應環境變化，但當環境過于苛刻，或超出酵母適應范圍，會對酵母的發酵性能以及生理特性等造成不利的影響[10]。

高濃麥汁中補充營養物質是一種行之有效的方法。在高濃麥汁中添加氮源、麥角固醇以及油酸時，可促進酵母生長、提高乙醇產量，發酵結束時活細胞率仍保持在較高水平[11]。添加S-腺苷甲硫氨酸可提高巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）在高濃釀造過程中的發酵速率[1]。在麥汁中直接添加氨基酸、肽、蛋白水解物或蛋白酶，也可提高酵母在高濃釀造過程中的發酵性能：乙醇對細胞的生長具有抑制作用，但添加精氨酸可以大大減輕乙醇損傷，相反，當胞內精氨酸含量減少時，酵母細胞對乙醇濃度更敏感[12]。

紅棗（Ziziphus jujubaMill）是鼠李科屬植物棗樹的成熟果實，營養豐富，藥用價值高，富含蛋白質、脂肪、多糖、胡蘿卜素、B族維生素、維生素C、維生素P以及鈣、磷、鐵等成分，其中維生素C的含量在果品中名列前茅，有“天然維生素丸”之美稱。我國是世界上最大的紅棗生產國，同時也是最大的紅棗及其加工品出口國，全球90%以上的紅棗都由我國供應，市場占有率高。2018年全國紅棗年產量高達883多萬噸，占世界總產量的1/3。在人們生活水平不斷提高的當今社會，隨著保健食品行業的快速興起，紅棗以其豐富的營養價值及多種保健功能成為人們關注的焦點[13]。

本研究以紅棗作為營養補充劑，通過制備紅棗汁，將紅棗汁添加到高濃麥汁中進行啤酒發酵，分析其對高濃釀造過程中酵母發酵性能及啤酒風味的影響。研究結果對啤酒高濃釀造工業生產中通過營養物調控酵母發酵性能的實踐研究具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）BF16：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 原料與試劑

陜北木棗：采于榆林市清澗縣；青島純生啤酒：市售；大麥芽：廈門市老啤匠貿易有限公司；酒花顆粒：西安雪花啤酒有限公司；麥芽糖漿：湖北千鳳香食品有限公司；2-辛醇（色譜純）：范德（北京）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

R-100旋轉蒸發儀：瑞士步琦有限公司；WGL-230B烘箱：上海精宏實驗設備有限公司；CM-5色差計：科電貿易（上海）有限公司；LRH-250CL低溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；PAL-1數字手持折射儀：日本ATAGO（愛宕）公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；GL-10MD高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；DMA 35安東帕便攜式密度計：奧地利安東帕有限公司；GCMSQP2010 Ultra氣相色譜-質譜聯用儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高濃麥汁的制備

稱取一定量的大麥芽，粉碎并過篩，以料液比1∶4（g∶mL）加入45 ℃蒸餾水，攪拌并開始糖化，糖化程序如下：在45 ℃下保溫30 min；升溫至63 ℃并保溫60 min；再升溫至72 ℃并保溫10 min；最后將溫度升至78 ℃，保溫10 min。均以1 ℃/min的速率升溫。

糖化結束后，將麥汁迅速冷卻至45 ℃后過濾，將濾液再次加溫至沸騰，保持沸騰狀態90 min。在麥汁沸騰后，分3次添加酒花顆粒[14]，添加量為麥芽質量的0.2%。

煮沸完成后，將麥汁再次過濾，使用蒸餾水調整麥汁濃度至常濃（12°P）。向常濃麥汁中加入麥芽糖漿，調整濃度至24°P，并分裝至2 L的錐形瓶中。將所得高濃麥汁進行高壓滅菌（121 ℃，15 min）。

1.3.2 紅棗汁制備

稱取一定量的紅棗，洗凈后加入一定量溫水浸泡10min，破碎后于45 ℃下浸提4 h，料液比為1∶4（g∶mL）。浸提完成后，將棗汁進行過濾。使用旋轉蒸發儀將所得棗汁進行濃縮，調整紅棗汁糖度與高濃麥汁一致，將棗汁進行巴氏殺菌（80 ℃，10 min），備用，高濃麥汁和高濃紅棗汁的氨基酸組成見表1。

表1 高濃麥汁和高濃紅棗汁的氨基酸組成Table 1 Composition of amino acids in high gravity wort and jujube juice

1.3.3 接種酵母及啤酒發酵

分別添加10%、15%、20%、25%、30%、35%的紅棗汁于高濃麥汁中。對麥汁進行高溫滅菌（121 ℃，15 min）。以2 g/L的接種量接種酵母。無菌條件下，先以少量麥汁將活性干酵母活化（37 ℃，30 min），之后將酵母轉移至錐形瓶中，開始發酵。接種酵母后，將錐形瓶轉移至低溫培養箱中，于12 ℃下進行發酵。發酵期間，每日搖瓶稱質量。當發酵結束后，將發酵液離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），離心所得酵母泥用于酵母計數及測定活細胞率，上清液保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 分析檢測

（1）發酵度測定

使用附溫比重瓶對發酵后的麥汁濃度進行測定：將比重瓶洗凈烘干至恒質量，將蒸餾水或離心所得上清液緩慢倒入比重瓶中，避免產生氣泡。使之升溫至20 ℃并準確稱量其在該溫度下的質量，計算得到麥汁與蒸餾水的質量比。根據比重與浸出物質量百分含量對照表查得20 ℃下麥汁中浸出物含量，并以°P表示。發酵度計算公式如下：

（2）酒精度測定

使用密度計直接對酒精度進行測定：取離心后上清液與蒸餾水各50 mL，加入蒸餾燒瓶中進行蒸餾，準確收集餾出液50 mL，用儀器直接吸取餾出液并讀數，酒精度單位以體積分數%vol表示。

（3）風味物質測定

采用氣相色譜-質譜聯用法，與常婷婷等[15]相同的條件進行分析：在20 mL頂空瓶中加入6 mL樣品、1.5 g NaCl以及20 mg/mL的2-辛醇標準溶液20 μL，此時樣品中2-辛醇實際質量濃度為66.7 μg/mL，加蓋密封后進行測定分析。未知化合物經計算機檢索同時與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）和Wileylibrary數據庫相匹配，保留指數＞85的結果，所得風味物質為相對于內標的含量。

色譜條件：色譜柱為DB-1 ms毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始柱溫40 ℃；進樣口溫度230 ℃；程序升溫：40℃保持3min，然后以4℃/min速度升至120 ℃，再以6 ℃/min升至240℃，保持9min；載氣為高純氦氣（He），流速1.0mL/min；不分流進樣。

質譜條件：離子源溫度為230 ℃，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70eV，質量掃描范圍35～400amu。

（4）色值測定

使用色差儀對啤酒的色值進行測定。以商品啤酒青島純生作為對照，根據發酵得到啤酒的酒精度，按不同比例將之稀釋至與青島純生相同的酒精度（3.3%vol）。使用蒸餾水對色差儀進行調零，測定所有樣品與青島純生的L*值、a*值、b*值，計算總色差，其計算公式如下：

式中：ΔE為總色差；ΔL*為明度差；Δa*為紅綠色差；Δb*為黃藍色差。

1.3.5 數據分析

各數據均為3次測定的平均值，采用Minitab 18（Minitab Inc.）進行數據分析，采用Fisher最小顯著差數（least significant difference，LSD）法進行顯著性分析。其中，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。使用Excel 2019作圖。

2 結果與分析

2.1 添加紅棗汁對高濃釀造過程中CO2質量損失的影響

添加不同比例紅棗汁進行啤酒發酵的過程中，CO2質量損失情況見圖1。由圖1可知，接種酵母后的第1天，各組CO2質量損失均較少。從第2天開始CO2質量損失迅速增加，單日質量損失量達到峰值。其中添加15%紅棗汁組最高單日CO2質量損失達9.8 g/L。隨后增速減緩，曲線趨于平穩。發酵結束時，對照組總CO2質量損失為92.6 g/L，添加15%紅棗汁組總CO2質量損失為95.2 g/L，添加25%紅棗汁組最低為92.6 g/L。

圖1 發酵期間各組CO2質量損失Fig.1 CO2 mass loss of each group during the fermentation

在發酵前期（發酵開始至第5天），添加不同比例紅棗汁的樣品組總CO2質量損失均高于對照組；發酵中期（6～12 d），對照組總CO2質量損失反超各紅棗汁添加組；發酵臨近結束時（13～14 d），所有添加紅棗汁的樣品組總CO2質量損失再次超過對照組。這可能是由于發酵前期麥汁體系的滲透壓較高，添加紅棗汁提高了酵母細胞對高滲透壓的耐受性，因此在發酵前期酵母的活性更強，表現出更高的發酵能力，酵母細胞可以快速消耗利用各種營養物質進行生長繁殖與發酵，產生大量的代謝物，如乙醇等[16-17]。與麥汁相比，紅棗汁富含脯氨酸（表1），已有研究表明，脯氨酸可參與酵母提高自身耐受性的分子機制，保持胞內蛋白和質膜的穩定性、降低脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的熔解溫度（Tm）值、清除活性氧自由基等[18]。

2.2 添加紅棗汁對麥汁發酵度和乙醇產量的影響

發酵度反映了酵母對糖的消耗利用程度，各組發酵度結果見圖2。由圖2可知，添加不同比例的紅棗汁均能顯著提高發酵度（P＜0.01），其中對照組發酵度最低，為84.66%；30%紅棗汁組發酵度最高，為88.18%，其次是35%紅棗汁組，發酵度達87.90%。在本試驗紅棗汁添加范圍內（10%～35%），發酵度由高到低可分為四組：30%、35%＞20%、25%、15%＞10%＞對照（組內不存在顯著差異）。結果表明，紅棗汁添加量越高，最終的發酵度也越高。

各組乙醇產量結果見圖3。由圖3可知，添加不同比例的紅棗汁均能一定程度提高乙醇產量，其中，對照組酒精度為10.80%vol。15%、35%紅棗汁組顯著高于對照組（P＜0.05），30%紅棗汁組酒精度達11.30%vol，極顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖2 添加紅棗汁對麥汁發酵度的影響Fig.2 Effect of jujube juice supplementation on wort fermentation degree

圖3 添加紅棗汁對乙醇產量的影響Fig.3 Effect of jujube juice supplementation on ethanol production

本研究結果與文獻[19]報道結果類似，可能是由于相較于麥汁中較為單一的營養組成，紅棗汁的成分更為復雜多樣，其中的高含量脯氨酸有助于提高酵母細胞在高濃環境下的活力，促進細胞對糖的利用與轉化，使細胞能夠在更高的乙醇濃度下依然保持提高乙醇產量，并且對高乙醇濃度具有更高的耐受性。

2.3 添加紅棗汁對啤酒色值的影響

顏色是啤酒重要的感官指標之一，啤酒的顏色給消費者的第一印象是消費者選擇啤酒時的重要依據。通常用EBC值來反映啤酒的色度，國標GB 4927—2008《啤酒》中規定，色度2～14 EBC的為淡色啤酒，15～40 EBC為濃色啤酒，41 EBC以上為黑色啤酒。但是EBC比色法需要實驗人員肉眼觀察，人為因素導致的誤差更大。采用國際照明委員會（commission internationale de l'Eclairage，CIE）的Lab顏色體系，對啤酒的色值進行表示與分析。不同紅棗汁添加量對啤酒色值的影響見表2。

對照組及各樣品組均與青島純生進行比較。由表1可知，各組在L*值、a*值、b*值上均與青島純生啤酒存在顯著差異（P＜0.05），其中對照組與青島純生之間的差異最小。隨著紅棗汁添加比例越高，啤酒的L*值降低，a*值升高，b*值升高，總色差（ΔE）值越大。35%紅棗汁組亮度最低，a*值與b*值最高，與青島純生及對照組的差異最大。

表2 紅棗汁添加量對啤酒色值的影響Table 2 Effect of jujube juice supplementation on beer color value

在Lab顏色體系中，L*值表示亮度，a*值由負到正表示由綠到紅，b*值由負到正表示由藍到黃，即紅棗汁的添加導致啤酒的亮度下降，并呈現出更多的紅色與黃色。這是由于紅棗汁中含有豐富的色素，當紅棗汁的添加比例增加時，溶解到啤酒中的色素也越多，因此啤酒的色值與紅棗汁的添加量同步變化。

2.4 添加紅棗汁對啤酒風味物質的影響

添加不同比例的紅棗汁對啤酒風味的影響見表3。由表3可知，在7個組中一共檢測到50種揮發性風味物質，包括10種醇類物質、33種酯類物質和7種酸類物質，其中以醇類、酯類物質含量最高。在所有樣品中風味物質含量較高的有：異戊醇、活性戊醇、苯乙醇三種醇類物質，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙基9-癸烯酸酯、癸酸乙酯六種酯類物質。在對照組中，醇類及酯類物質含量占風味物質總量的94.1%。添加紅棗汁導致啤酒的醇酯比有所降低，這是由于總醇的含量降幅大于總酯含量降幅，其中主要是異戊醇、活性戊醇等高級醇含量降低。高級醇是大多數風味酯的前體物質，并且高級醇的產生與蛋白質的合成之間有著密切的聯系，它是氨基酸分解代謝的副產物。而細胞對乙酸酯類的合成則主要由醇乙酰基轉移酶催化一分子高級醇（或乙醇）和一分子活化的乙酰輔酶A形成。添加紅棗汁導致啤酒異戊醇含量僅為對照組的69.3%～77.9%，活性戊醇含量為對照組的68.8%～74.8%。對照組表現在最高的醇酯比，為1.01，而添加20%和25%紅棗汁的啤酒表現出了最低的醇酯比，均為0.87。高級醇是導致啤酒“上頭”的主要原因[20]，因此，高級醇含量的降低可以減輕飲用啤酒對身體造成的不適，有益身體健康。結果表明，添加紅棗汁進行發酵的啤酒表現出較強的酯香味，而且口感均衡。

表3 添加紅棗汁對啤酒風味物質組成的影響Table 3 Effect of jujube juice supplementation on the composition of beer flavor substance

續表

3 結論

在啤酒高濃釀造過程中添加紅棗汁，可以提高發酵初期的發酵速率，更快的發酵速度能縮短發酵周期。添加紅棗汁能夠提高發酵結束時的麥汁發酵度及乙醇產量，其中，30%的紅棗汁添加量效果最好，發酵度及乙醇產量分別比對照組提高了4.16%和4.63%。添加紅棗汁可改變啤酒的顏色：L*值降低，a*值與b*值升高，即降低啤酒的亮度，并使啤酒呈現出更多的黃色與紅色，即表現出更多與紅棗相似的感官特性。紅棗汁的添加可有效降低啤酒醇酯比，使啤酒的口感更加均衡與柔和。