寧夏賀蘭山東麓降L-蘋果酸葡萄酒酵母的篩選

白玉峰，張文霞，田亞楠，張秀艷*

（1.華中農業大學 食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學 環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

蘋果酸是葡萄果實成熟過程中形成的一種重要的有機酸，它的含量因葡萄品種以及葡萄成熟的條件不同而不同，過量蘋果酸會影響葡萄酒的酸度和感官品質[1]。葡萄中的蘋果酸異構體為L型[2]，L-蘋果酸不僅影響葡萄酒的酸度及感官品質，而且影響葡萄酒中微生物穩定性，因其它微生物可利用L-蘋果酸為底物進行生長，進而造成葡萄酒腐敗變質[3-4]。降解葡萄酒中過量的L-蘋果酸可提高葡萄酒的風味品質。用于葡萄酒發酵的釀酒酵母并不能有效降解L-蘋果酸，因此需要采用具有降解蘋果酸能力菌株進行降酸。

一直以來，多采用乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）進行蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF），將L-蘋果酸轉化為L-乳酸，降低葡萄酒酸度、改善葡萄酒感官特性。然而，乳酸菌在葡萄酒的特殊環境（如低pH值、高SO2、高乙醇、中鏈脂肪酸等）生長和發酵緩慢[5]，且可能會產生生物胺（如腐胺、組胺、酪胺和尸胺）、氨基甲酸乙酯等有害物質[6-8]。MLF結束后，如果乳酸菌發酵終止不徹底，葡萄酒可因乳酸菌生長而產生生物渾濁，進而降低葡萄酒品質[9]。

實際上，一些非釀酒酵母也可降解L-蘋果酸，利用降酸酵母代替乳酸菌進行降酸發酵可在某種程度上解決乳酸菌發酵存在的問題[10-13]。項目組前期已從寧夏賀蘭山東麓葡萄產區的自然發酵赤霞珠葡萄汁中分離了7種，共計299株酵母菌株。為了分析已分離酵母菌降解L-蘋果酸的能力，本研究采用L-蘋果酸降解指示培養基顯色法和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析其降解L-蘋果酸的性能，為葡萄酒降酸提供了新的菌種資源，為酵母菌開發和利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗所用酵母菌均分離自賀蘭山東麓葡萄產區的自然發酵赤霞珠葡萄酒，見表1。

表1 實驗用酵母菌株Table 1 Yeast strains used in the experiment

1.1.2 試劑

無氨基酵母氮源（yeastnitrogenbasewithoutaminoacids，YNB）、硫酸銨、溴甲酚綠（均為化學純）、磷酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；L-蘋果酸（化學純）：北京索萊寶科技有限公司；L-蘋果酸（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸粉蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，蒸餾水配制，121 ℃滅菌20 min。

酵母浸粉蛋白胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose agar，YPDA）培養基：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.5%，蒸餾水配制，121 ℃滅菌20 min。

蘋果酸降解指示培養基：YNB 1.7 g/L，硫酸銨5 g/L，L-蘋果酸20 g/L，溴甲酚綠0.1 g/L，以雙蒸水配制，0.45 μm濾膜過濾除菌。

1.2 儀器與設備

SZ-93自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；HZ200L恒溫搖床：武漢瑞華儀器設備有限責任公司；SHZ-D循環水式多用真空泵：鄭州特爾儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌降L-蘋果酸的定性分析

采用蘋果酸降解指示培養基顯色法進行降酸酵母的初篩，參照OSOTHSILP C等[14]的方法。用接種環取2環YPDA斜面培養基上的酵母菌，接種到裝液量為30 mL/100 mLYPD培養基中，28 ℃、120 r/min恒溫搖床培養24 h進行活化?；罨蟮慕湍妇?06CFU/mL接種到裝有30 mL蘋果酸降解指示培養基的100 mL三角瓶中，25 ℃、120 r/min恒溫搖床培養10 d，以空白指示培養基作為對照，每株菌做2個平行。自培養第1天開始每天觀察和記錄培養基的顏色。

培養基中添加L-蘋果酸作為主要碳源，溴甲酚綠作為酸堿指示劑，若待測菌株具有代謝L-蘋果酸的能力，則隨著菌株代謝能力的增強，培養基中L-蘋果酸逐漸被消耗，pH值隨之升高，則培養基的顏色呈現從黃色到藍色的轉變，當培養基pH 3.3時呈黃色，pH 4.5時開始出現顏色的明顯變化，pH 5.4時呈藍色。

1.3.2 酵母菌降L-蘋果酸的定量分析

根據GB 5009.157—2006《食品中有機酸的測定》，采用HPLC對蘋果酸降解指示培養基中的蘋果酸含量進行定量檢測，方法如下：

0.1%磷酸溶液配制：磷酸1 mL，加水至1 000 mL并混勻，用0.22 μm濾膜過濾備用。HPLC的流動相為0.1%磷酸溶液和甲醇，二者體積比例為97.5∶2.5。

標準L-蘋果酸溶液配制：準確稱取L-蘋果酸標準品0.5 g，加入0.1%的磷酸溶液并定容至10 mL以配制50 mg/mL蘋果酸的儲備液；然后用0.1%的磷酸溶液稀釋儲備液，分別使L-蘋果酸質量濃度達1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和30 mg/mL，于4 ℃保存。

樣品處理：將培養10 d的蘋果酸降解指示培養基倒入50 mL離心管離心10 min（4 ℃、8 000 r/min），取上清并用0.22 μm濾膜過濾并進行檢測。

色譜條件：色譜柱為inertsilODS-3C18柱（4.6 mm×250mm），流動相使用前用超聲波脫氣5 min，總流速0.7 mL/min，檢測波長為210nm，柱溫40℃，進樣量為20μL，檢測時間為20min。

1.3.3 數據統計處理與分析

采用Microsoft Office 2016和GraphPad Prism 6對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同酵母菌株降L-蘋果酸的定性分析

為了解不同酵母菌株的L-蘋果酸降解能力，將不同酵母菌按106CFU/mL接種于蘋果酸降解指示培養基，以不接種酵母的空白指示培養基為對照，28 ℃培養10 d，觀察其降酸能力，若酵母培養液呈藍色，則表示其降酸能力強，呈綠色表示其降酸能力較強，呈黃綠色表示其降酸能力弱，若酵母培養液不變色（黃色），則表示其不降酸。顯色結果表示，304株酵母菌中有21株具有降L-蘋果酸能力的酵母菌株。其中有19株酵母菌降酸能力強，分別是菌株HI-5、HI-6、HII-17、H-II-2、H-II-13、H-II-16、YI-1-1、YI-1-2、YI-2、YI-9-1、YI-9-2、YI-9-3、YII-1、YIII-9、LI-6、LI-9、LI-10、LI-13、L-II-8。菌株G-II-18降酸能力較強，菌株Hlast-35降酸能力弱，而其余菌株均無降酸能力。對降L-蘋果酸的酵母菌株的定性分析結果表明不同酵母菌株的降酸能力不同。前期研究表明，拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、園球形假絲酵母（Candida sphaerica）、嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）、樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）、解蘋果酸裂殖酵母（Schizosaccharomyces malidevorans）和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）等菌株均具有降解L-蘋果酸的能力，且不同種酵母菌株的降酸能力不同[15-17]。

2.2 L-蘋果酸標準曲線

采用高效液相色譜分別分析1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和30 mg/mL的L-蘋果酸標準溶液。以標準液的質量濃度（x）為橫坐標，以色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，L-蘋果酸標準曲線回歸方程為y=1.2523x+1.1093，R2=0.9992，二者線性關系良好。

圖1 L-蘋果酸標準曲線Fig.1 Standard curve of L-malic acid

2.3 酵母菌株降L-蘋果酸的定量分析

為了進一步定量分析不同種酵母菌株的L-蘋果酸降解能力，采用HPLC對發酵10 d的上清液中L-蘋果酸的含量進行分析，以空白培養基為對照，計算其降酸率。

2.3.1 不同美極梅齊酵母降L-蘋果酸能力的定量分析

不同美極梅齊酵母（Metschnikowia pulcherrima）菌株降酸能力的定量分析結果見圖2。由圖2可知，菌株GI-1的降酸率為24.05%，菌株YII-1的降酸率為89.48%，而其他11株M.pulcherrima的降酸率均＞90%，這說明M.pulcherrima菌株均可降解L-蘋果酸，且多數菌株降酸能力較強。前期研究表明，M.pulcherrima可有效改善葡萄酒的風味和品質。BENITOME等[18]將M.pulcherrima與釀酒酵母序列接種于雷司令葡萄汁中，可顯著提高葡萄酒的果香風味。RODRIGUEZ M E等[19]將M.pulcherrima與釀酒酵母序列接種于馬斯喀特葡萄汁中，釀造的葡萄酒中α-松油醇含量增加，提高了葡萄酒的花香風味。但關于降解L-蘋果酸的M.pulcherrima菌株研究尚未見報道。

圖2 不同美極梅齊酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.2 Analysis of L-malic acid degradation ability of different strains of Metschnikowia pulcherrima

2.3.2 不同星形假絲酵母菌株降L-蘋果酸能力的定量分析

圖3 不同星形假絲酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.3 Analysis of L-malic acid degradation ability of different strains of Candida zemplinina

不同星形假絲酵母（Candida zemplinina）菌株降L-蘋果酸能力的定量分析結果見圖3。由圖3可知，13株酵母降酸能力均低于30%。然而，APONTE M等[20]在用艾格尼科葡萄進行微發酵評估時發現C.zemplinina能產生大量甘油，且能夠代謝所有的果糖和蘋果酸。篩選結果與文獻報道不符，可能與同種酵母不同菌株之間的降酸差異性不同有關。

2.3.3 戴爾有孢圓酵母、加利福尼亞假絲酵母及不同庫德畢赤酵母降L-蘋果酸能力的定量分析

戴爾有孢圓酵母（Y-III-2-1）、加利福尼亞假絲酵母（Hlast-35）及不同庫德畢赤酵母（LI-6、LI-13、YI-2）菌株降L-蘋果酸能力的定量分析結果見圖4。由圖4可知，戴爾有孢圓酵母的降酸率為6.13%，加利福尼亞假絲酵母的降酸率為34.77%。庫德畢赤酵母（P.kudriavzevii）YI-2的降酸率為85.46%，P.kudriavzeviiLI-6和P.kudriavzeviiLI-13降酸率分別為99.55%及99.21%。事實上，SEO S等[21]從韓國葡萄酒渣中分離到一株具有降解L-蘋果酸的P.kudriavzeviiKMBL 5774，降酸率為95.5%，DEL MóNACO S M等[22]分離出一株降酸菌株P.kudriavzeviiNNI15，且在發酵過程中高產甘油、低產乙醇，能顯著提高葡萄酒果香。

圖4 戴爾有孢圓酵母、加利福尼亞假絲酵母及不同庫德畢赤酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.4 Analysis of L-malic acid degradation ability of Torulaspora delbrueckii, Candida californica and different strains of Candida zemplinina

2.3.4 不同葡萄有孢漢遜酵母菌株降L-蘋果酸能力的定量分析

不同葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）菌株降L-蘋果酸能力的定量分析結果見圖5。由圖5可知，菌株G-II-18、L-II-8、H-II-2、H-II-13和H-II-16降解L-蘋果酸能力較強，其降酸率分別為71.20%、86.30%、85.88%、86.62%和81.44%，其余均低于30%。根據HUK等[23]的報道，將H.uvarum與釀酒酵母序列接種應用于黑比諾葡萄酒的釀造，葡萄酒中幾種C13-異戊二烯化合物和一些萜烯物質的濃度增加，增加了葡萄酒“熱帶水果”、“漿果”、“花香”和“堅果香”的風味特征。HERNANDEZ-ORTE P 等[24]研究發現，H.uvarum釋放的糖苷酶能促進萜烯類糖苷的水解，釋放出風味活性成分，改善葡萄酒的風味品質。然而，關于將H.uvarum應用于葡萄酒釀造降解其中L-蘋果酸的研究尚未見報道。

圖5 不同葡萄有孢漢遜酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.5 Analysis of L-malic acid degradation ability of different strains of Hanseniaspora uvarum

2.3.5 不同釀酒酵母菌株降L-蘋果酸能力的定量分析

據文獻報道，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因不含蘋果酸通透酶而不具有代謝L-蘋果酸的能力[25]，為了驗證鑒定保藏的S.cerevisiae是否具有降酸能力，從鑒定的176株S.cerevisiae隨機選取4株進行降L-蘋果酸定量分析。結果見圖6。由圖6可知，菌株LIII-7、Glast-33-1、Hlast-2和GIII-16的降酸率分別為5.93%、13.91%、0.86%和12.03%，這說明S.cerevisiae降解L-蘋果酸的能力較低，與文獻報道相符。

圖6 不同釀酒酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.6 Analysis of L-malic acid degradation ability of different strains of Saccharomyces cerevisiae

2.4 不同種酵母降L-蘋果酸能力統計分析

對不同種酵母菌株降L-蘋果酸性能進行統計分析，結果見表2。由表2可知，不同種酵母菌株降解L-蘋果酸的能力存在明顯差異，即使同一種內，不同菌株降解蘋果酸的能力也不盡相同。M.pulcherrima、P.kudriavzevii和H.uvarum中的部分菌株降解蘋果酸能力較強。其中P.kudriavzevii降解蘋果酸的能力較強，而M.pulcherrima和H.uvarum降解蘋果酸的能力則出現了明顯的種內差異，產生這個現象的原因還有待探究。此外，在C.zemplinina、T.delbrueckii、C.californica和S.cerevisiae中并未發現能夠明顯降解L-蘋果酸的菌株。

表2 不同種的酵母菌株降L-蘋果酸能力統計分析Table 2 Statistical analysis of L-malic acid degradation ability of different yeast species

3 結論

采用蘋果酸降解指示培養基顯色法和HPLC對自然發酵液中分離、鑒定的酵母菌株的降解L-蘋果酸能力進行定性和定量分析，共分離到13株強降酸酵母，降酸率均在90%以上。其中菌株HI-5、HI-6、HII-17、LI-9、LI-10、YI-1-1、YI-1-2、YI-9-1、YI-9-2、YI-9-3、YIII-9屬于M.pulcherrima，LI-6、LI-13屬于P.kudriavzevii的。然而不同種酵母菌株間呈現出L-蘋果酸降解能力的明顯差異，且同一種的不同酵母菌株間也存在降酸能力的明顯差異。降L-蘋果酸酵母菌株的獲得為葡萄酒降酸提供新的菌種資源，為酵母菌開發利用提供借鑒。然而，篩選得到的降解L-蘋果酸的酵母菌株屬于非釀酒酵母，該類酵母發酵糖產生酒精的能力較弱，所以在用于葡萄酒釀造時，需與釀酒酵母混合發酵才能同時達到降酸和發酵產酒的目的[26]，但關于二者混合發酵降酸工藝需要進一步探究。