血橙花色苷大孔樹脂純化工藝及抗氧化研究

胥 萍，林小靖，付紅偉

(1.浙江大學自貢創新中心，四川自貢 643000；2.浙江大學華南工業研究院，廣東廣州 510000；3.浙江大學，浙江杭州 310000)

血橙[CitrussinensisL.(Osbeck)]屬于蕓香科柑橘屬甜橙類[1]，果實含有豐富的活性物質，如花色苷、類黃酮、羥基肉桂酸、抗壞血酸等[2-3]。花色苷的含量被認為是血橙果實的重要品質指標，其抗氧化活性對人體健康也具有重要意義[4]。血橙中含有的花色苷對人體健康有益，可以抗癌、預防糖尿病和心臟病(動脈硬化)、抗氧化及抗衰老等[5-6]。大孔樹脂是一類具有大孔結構的有機聚合物吸附劑，廣泛應用于生物化學上的分離純化。大孔樹脂相比于其他的純化方式，具有大孔網狀結構和大比表面積、吸附速度快、選擇性好、可循環使用且再生處理經濟環保、方便制劑成型等優勢[7-8]。本實驗比較了四種大孔樹脂對血橙花色苷的吸附分離效果，對其吸附解吸性能進行研究，旨在從中篩選出較為合適的血橙花色苷分離純化樹脂類型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血橙果實采摘自四川省資中縣血橙基地。大孔樹脂D101、HPD-300、NKA-9：滄州寶恩化工公司；大孔樹脂AB-8：天津允開公司。檸檬酸、氯化鉀和鹽酸：廣州試劑廠。

紫外可見分光光度計：島津 UV-1800；搖床：江蘇太倉TH2-C-1；pH計：賽多利斯PB-10。

1.2 實驗方法

1.2.1 血橙花色苷粗品制備

將新鮮血橙果實去皮后打成勻漿，將其置于離心機4 000 r·min-1離心15 min，取上清液備用，即得血橙花色苷粗品[9]。

1.2.2 pH差示法測定血橙花色苷含量

參考文獻[9]，采用pH差示法測定血橙花色苷含量。

準確稱取1.00 g的各類型大孔吸附樹脂，置于具塞錐形瓶中，加入血橙花色苷粗品20 mL，在25 ℃恒溫條件下以120 r·min-1的轉速攪拌3 h。測定花色苷的含量，實驗設3個平行試驗。吸附平衡后，先用去離子水洗滌2次后，再加入10 mL的50%乙醇到含有1.00 g吸附飽和樹脂的具塞錐形瓶中。在25 ℃恒溫條件下以120 r·min-1的速度震蕩1 h。測定解吸后的花色苷含量，計算不同型號樹脂的吸附率和解吸率。吸附率和解吸率計算公式如下：

吸附率=(C1-C2)/C1×100%

解吸率=C3/(C1-C2)×100%

上式中，C1為溶液在吸附前的花色苷含量，C2為吸附完全后的花色苷含量，C3為經過吸附后解吸液的花色苷含量。

1.2.4 確定血橙花色苷大孔樹脂的最佳吸附時間

稱取上述試驗篩選出的大孔吸附樹脂1.00 g，置于具塞錐形瓶中，加入血橙花色苷粗品20 mL，放于搖床中，震蕩轉速為120 r·min-1，在不同時間測定吸附液中血橙花色苷的含量，直至達到平衡。實驗設3個平行試驗。

1.2.5 不同濃度乙醇對大孔吸附樹脂靜態解吸血橙花色苷影響

稱量1.00 g吸附飽和花色苷的大孔樹脂，分別加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%乙醇洗脫液10 mL，測定溶液中花色苷的含量。實驗設3個平行試驗。

1.2.5.2 攻毒。于14日齡將制備的IBDV懸液采用滴眼、刷肛法對Ⅰ～Ⅳ組試驗雞進行攻毒，攻毒劑量為0.5 mL/只。攻毒后24～48 h試驗雞均出現典型的IBD癥狀；攻毒后60～72 h出現死亡。通過對解剖死亡雞的觀察發現雞的胸肌、腿肌均有血斑，法氏囊和腎臟腫大，觸之堅硬，腎臟有尿酸沉積[4]，表現為典型的IBD癥狀，攻毒有效率為100%。

1.2.6 洗脫液pH對大孔吸附樹脂靜態解吸血橙花色苷的影響

稱取吸附飽和花色苷的大孔樹脂1.00 g于10 mL pH值分別為1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的60%乙醇解吸液中，測定解吸后的花色苷含量。實驗設3個平行試驗。

1.2.7 樹脂吸附血橙花色苷泄露曲線的繪制

取10 mL預處理后的大孔樹脂，濕填料于柱中，然后流速為2 mL·min-1上樣。流出液每10 mL收集1次流份，并測定每個流份的吸光值，當流出液的花色苷含量達到上樣液花色苷含量的1/10時，認為已經有花色苷泄露，據此繪制泄露曲線[10]。

1.2.8 大孔樹脂動態解吸體積測定

量取10 mL預處理后的樹脂進行濕法裝柱，血橙花色苷粗品上樣于樹脂柱達到吸附飽和后先用去離子水洗滌，再用60%乙醇洗脫，洗脫流速為2 mL·min-1，每10 mL收集1次流份，并測定每個流份的吸光值，據此繪制洗脫曲線。

1.2.9 血橙花色苷色價測定

參照《中國人民共和國國家標準GB6718-86》方法測定血橙花色苷色價。

1.2.10 血橙花色苷清除DPPH自由基能力測定

配制 0.06 mmol·L-1DPPH溶液，取5 mL DPPH溶液加入1 mL的待測溶液，搖勻，避光反應30 min。每個樣品做三個平行。以去離子水為參比，在518 nm處測各待測液的吸光值，然后計算清除率。

1.2.11 血橙花色苷清除ABTS自由基能力測定

配制7 mmol·L-1ABTS溶液，加入0.88 mL(14 mmol·L-1)過硫酸鉀溶液，室溫避光靜置過夜，用無水乙醇稀釋此液至734 nm處測得的吸光度為 0.70±0.02，即得ABTS工作液。取7.8 mL ABTS工作液加入200 μL的待測液，搖勻，避光反應10 min。每個樣品做三個平行。以去離子水為參比，在734 nm處測各待測液的吸光值，然后計算清除率。

2 結果與分析

2.1 四種大孔樹脂對血橙花色苷的靜態吸附與解吸作用

由表1可以看出，四種大孔樹脂對血橙花色苷均有一定的吸附作用，樹脂的吸附和解吸性能與樹脂的性質和溶質的化學性質有關。其中樹脂D101、HPD-300略高于其余2種樹脂，表明在靜態吸附階段，D101、HPD-300可以更好地吸附和保護花色苷，避免花色苷的損失。D101、AB-8大孔樹脂的解吸率較高，分別為65%、64%，說明在該解吸條件下D-101和AB-8相比于另外2種大孔樹脂能釋放更多的花色苷。通過以上分析可見，D101大孔樹脂對血橙花色苷的吸附和分離效果較好，于是對D101大孔樹脂進行了后續實驗。

表1 血橙花色苷在不同大孔樹脂上的吸附率和解吸率

2.2 大孔樹脂吸附花色苷的時間

由圖1可見，D101對血橙花色苷的吸附率在前0.5 h快速增加，1 h后緩慢增加，在2 h左右達到平衡，說明血橙花色苷在D101大孔樹脂上吸附2 h已經達到了平衡。

圖1 D101大孔樹脂對花色苷的靜態吸附作用

2.3 不同解吸液乙醇濃度對血橙花色苷靜態解吸的影響

為了選擇合適的解吸溶液，采用不同濃度的乙醇水溶液進行了解吸試驗。由表2結果可知，解吸率隨乙醇濃度的增加而增大，在60%濃度時達到峰值，然后隨乙醇濃度的增加而減小。因此，選擇60%乙醇水溶液作為花色苷的合適解吸溶液，用于花色苷的動態解吸實驗。

表2 不同的解吸液乙醇濃度對血橙花色苷靜態解吸的影響

2.4 不同解吸液pH對血橙花色苷靜態解吸的影響

不同解吸液pH對血橙花色苷解吸的影響表現為隨著pH值的升高，D101大孔樹脂對血橙花色苷的吸附率逐漸降低(見表3)，這與較高pH值條件下花色苷的穩定性較差有關。但pH值為1.0、2.0時的花色苷吸附率相差不多，由于較低的pH值容易使花色苷的糖基發生水解現象，影響花色苷分子的穩定性，吸附率下降，因此選擇pH值2.0最適合。

表3 解吸液pH值對解吸效果的影響

2.5 上樣體積對大孔吸附樹脂動態吸附血橙花色苷的影響

D101大孔樹脂對血橙花色苷的吸附泄漏曲線(見圖2)顯示，D101對血橙花色苷吸附量隨著上樣溶液體積的增大而增大，流出液體積由1 BV到10 BV的過程中，其吸光值的增加幅度較緩，而當流出液體積由10 BV上升到11 BV時吸光值的增加幅度明顯加大，出現了明顯差異。當流出液體積為11 BV時其吸光值已達到上樣溶液含量的1/10，即出現泄漏。

圖2 D101大孔樹脂對血橙花色苷的吸附泄漏曲線

2.6 大孔樹脂動態解吸體積測定

由圖3可以看出，酸化60%乙醇可洗脫D101大孔樹脂吸附的大部分花色苷，在前1 BV時即有檢測到花色苷流出，當洗脫體積達到8 BV時已洗脫出上樣花色苷總量的96%。

圖3 D101大孔樹脂動態解吸曲線

2.7 純化后花色苷產品色價測定

本實驗表明，經D101大孔樹脂純化后，血橙花色苷色價為48.4，呈現為紅色膏狀物；而未純化的血橙花色苷色價為0.8，呈現深紅色。

2.8 血橙花色苷清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是穩定的紫色自由基，可以用來衡量抗脂質氧化能力[11]。由圖4可見，血橙花色苷在濃度為(0.15～1.50 mg·mL-1)的范圍內，隨添加濃度的增大，對DPPH自由基的清除率隨之增大，清除率最高可達92.7%，IC50為0.437 mg·mL-1。

圖4 血橙花色苷清除DPPH自由基的能力

2.9 血橙花色苷清除ABTS自由基的能力

ABTS為一穩定的有機自由基，對其清除的能力直接反映出樣品抗氧化能力的大小[11]。由圖5可見，血橙花色苷在濃度為(0.22～1.63 mg·mL-1)的范圍內，隨添加濃度的增大，對ABTS自由基的清除率隨之增大，清除率最高可達89.2%，IC50為0.680 mg·mL-1。

圖5 血橙花色苷清除ABTS自由基的能力

3 結論

D101大孔樹脂對血橙中花色苷具有良好的吸附和解吸能力。吸附和解吸的最佳條件：上樣體積為10 BV，在2 h靜附后，大孔吸附樹脂的靜態吸附達到飽和，洗脫溶劑用pH值為2的60%乙醇，洗脫體積為8 BV。純化后的血橙花色苷為深紅色粉末。血橙花色苷具有較好的抗氧化性能，在一定的濃度范圍內，對DPPH自由基和ABTS自由基有一定的清除作用，其作用隨濃度的增加而增強。