規(guī)?；i場豬大腸桿菌的耐藥性及相關(guān)耐藥基因檢測

鄧珊珊，張 海，藺俐仲，徐春志，袁 林

（1.貴陽市清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽 551400；2.貴陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550081；3.貴陽市草地站，貴州 貴陽 550081；4.貴陽市息烽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽 550300）

細(xì)菌性腹瀉是引起仔豬腹瀉的主要病因之一，在非洲豬瘟疫情防控和政府對養(yǎng)豬業(yè)的大力支持下，近兩年來養(yǎng)殖規(guī)模不斷的擴(kuò)大，由于部分養(yǎng)殖場缺乏專業(yè)技術(shù)人員和有效的防護(hù)措施，仔豬細(xì)菌性腹瀉的發(fā)病率逐漸增加，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。仔豬感染細(xì)菌性腹瀉可致仔豬產(chǎn)生嚴(yán)重的水樣腹瀉、嘔吐、脫水，嚴(yán)重的可導(dǎo)致仔豬死亡[1]。引起仔豬腹瀉的主要病原菌有大腸桿菌、沙門氏菌、魏氏梭菌、鏈球菌和志賀氏菌等[2]。大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道中最常見、數(shù)量較多的細(xì)菌，當(dāng)人和動(dòng)物的機(jī)體免疫力下降時(shí)，細(xì)菌就會(huì)大量繁殖從而產(chǎn)生毒素，而引起機(jī)體發(fā)病。由于致病性大腸桿菌的血清型較多，目前沒有較為有效的疫苗預(yù)防[3]。在臨產(chǎn)床上常常使用抗生素治療仔豬的細(xì)菌性腹瀉，由于抗生素不合理使用和濫用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)了多重交叉耐藥株，使得在臨床對大腸桿菌病的治療變得越來越困難。

為了解貴州省某規(guī)模化豬場腹瀉大腸桿菌的耐藥情況，本研究對臨床上分離到的20株豬源大腸桿菌進(jìn)行藥物藥敏試驗(yàn)和相關(guān)耐藥基因的PCR檢測，同時(shí)對細(xì)菌的耐藥性和相應(yīng)耐藥基因關(guān)系進(jìn)行分析，為臨床合理用藥及大腸桿菌多重耐藥機(jī)制的進(jìn)一步研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年5月至2020年7月在貴州嘉農(nóng)種豬養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。

1.2 菌株

20株分離自貴州省某規(guī)模化養(yǎng)豬場送檢的腹瀉仔豬樣本的豬源大腸桿菌，由貴陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心分離、純化、鑒定、保存。

1.3 主要試劑和培養(yǎng)基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL 2 000、細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 藥敏紙片與藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)所用的抗菌藥物包括β-內(nèi)酰胺類的頭孢拉定、頭孢克洛、氨芐西林、青霉素、阿莫西林，氨基糖苷類的慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、鏈霉素、新霉素，氟喹諾酮類的恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、吡哌酸、諾氟沙星，共15種獸醫(yī)臨床常用藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按NCCLS 2010年標(biāo)準(zhǔn)作出結(jié)果判斷。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank上已發(fā)布的9種畜禽病原菌的相關(guān)耐藥基因序列，分別為β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CTX、SHV、TEM，氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrS、qnrB，氨基糖苷類耐藥基因aacC4、addA1、aacC2，運(yùn)用引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6 細(xì)菌基因組DNA的提取

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取試驗(yàn)菌株基因組DNA。

1.7 耐藥基因的PCR擴(kuò)增

以提取的大腸桿菌細(xì)菌基因組DNA為模板，按照25 μL PCR反應(yīng)體系分別加入各組分試劑2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板2.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1.5 μL，下游引物（10 μmol/L）1.5 μL，滅菌雙蒸水7.5 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物8.0 μL進(jìn)行電泳。

表1 耐藥基因PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對分離20株致仔豬腹瀉豬大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果顯示，分離的20株豬大腸桿菌對環(huán)丙沙星高度耐藥，耐藥率為100.00%（20/20）；對其余抗菌藥物的耐藥率分別為：阿莫西林、吡哌酸耐藥率為95.00%（19/20），青霉素耐藥率為90.00%（18/20），氨芐西林耐藥率為85.00%（17/20），諾氟沙星耐藥率為80.00%（16/20），恩諾沙星耐藥率為75.00%（15/20），頭孢拉定耐藥率為60.00%（12/20），卡那霉素、氧氟沙星耐藥率為45.00%（9/20），對新霉素、丁胺卡那、頭孢克洛、慶大霉素、鏈霉素的耐藥率分別為40.00%（8/20）、30.00%（6/20）、30.00%（6/20）、25.00%（5/20）、20.00%（4/20）。

分離出來的20株致仔豬腹瀉大腸桿菌中沒有對所有的抗菌藥物完全敏感的菌株。20株大腸桿菌對兩類以上的抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性，其中對β-內(nèi)酰胺類（阿莫西林、青霉素）和氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星和吡哌酸）耐藥最為普遍。20株大腸桿菌對10余種抗菌藥物有多重耐藥性。

表2 20株大腸桿菌分離株對15種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

2.2 耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對20株大腸桿菌進(jìn)行TEM、CTX、SHV、addA1、aacC2、aacC4、qnrA、qnrB和qnrS的PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出特異性目的片段，將目的片段回收后送測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，陽性菌株所攜帶的抗生素耐藥基因與GenBank中參考耐藥基因的序列同源性在98%以上，說明篩選出的9種耐藥基因是本試驗(yàn)要檢測的基因。耐藥基因檢測結(jié)果匯總見表3。

由表3可得，該規(guī)模化豬場20株豬大腸桿菌分別擴(kuò)增出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CTX-M、TEM和SHV的菌株比例分別為50.00%（10/20）、40.00%（8/20）和35.00%（7/20）；擴(kuò)增出氟喹諾酮耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS的菌株比例分別為35.00%（7/20）、15.00%（3/20）和20.00%（4/20）；擴(kuò)增出氨基糖苷類耐藥基因addA1、aacC2和aacC4的菌株比例分別為75.00%（15/20）、80.00%（16/20）和65.00%（13/20）。

表3 20株大腸桿菌耐藥基因檢測情況

3 討論

本研究調(diào)查了分離自貴州省某規(guī)?；i場致仔豬腹瀉的20株大腸桿菌對3類15種抗菌藥物的藥物敏感性和耐藥情況，以及采用PCR檢測法對9種耐藥基因攜帶情況，并進(jìn)行耐藥基因與耐藥表型相關(guān)性的分析。

該豬場致腹瀉大腸桿菌抗生素藥物敏感性高于50%的有8種抗生素，其中4種屬于β-內(nèi)酰胺類、4種屬于氟喹諾酮類，藥物敏感性超過80%的藥物有環(huán)丙沙星100.00%（20/20），阿莫西林95.00%（19/20）、吡哌酸95.00%（19/20）、青霉素90.00%（18/20）、氨芐西林85.00%（17/20），檢測結(jié)果與徐引弟等[4]研究人員的研究結(jié)果相似，提示臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎用藥。諾氟沙星、恩諾沙星、頭孢拉定、氧氟沙星、卡那霉素，在臨床上可選擇性用藥。新霉素、丁胺卡那、頭孢克洛、慶大霉素、鏈霉素，在臨床上可以繼續(xù)使用。20株大腸桿菌對兩類以上的抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性，其中對β-內(nèi)酰胺類（阿莫西林、青霉素）和氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星和吡哌酸）耐藥最為普遍。20株大腸桿菌對10余種抗菌藥物有多重耐藥性。該豬場20株大腸桿菌耐藥基因氨基糖苷類耐藥基因檢測率最高，addA1、aacC2和aacC4的菌株比例分別為75.00%（15/20）、80.00%（16/20）和65.00%（13/20）。β-內(nèi)酰胺類耐藥基因次之，CTX-M、TEM和SHV的菌株比例分別為50.00%（10/20）、40.00%（8/20）和35.00%（7/20）。耐藥基因檢測結(jié)果與藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果存在一定的相關(guān)性。耐藥基因的檢測有助于了解該規(guī)?；B(yǎng)豬場大腸桿菌流行株耐藥基因存在的種類、數(shù)量及流行規(guī)律，能夠更好地指導(dǎo)臨床用藥，以降低大腸桿菌的耐藥性。

大腸桿菌是條件致病菌，其發(fā)病率與豬場的飼養(yǎng)管理、衛(wèi)生情況、氣候、溫度等有很大的關(guān)系，因此加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、注意養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生狀況和做好保暖措施等都可以大幅減少大腸桿菌引起的仔豬腹瀉。臨床上選擇敏感藥物，交替使用，從而減少耐藥性的產(chǎn)生，提高治療效果。