復(fù)方中藥對大腸桿菌脂多糖免疫應(yīng)激早期斷奶仔豬血清細(xì)胞因子的影響

孟冬霞，馬政禹，曹日亮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 晉中 030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

早期斷奶（21～35 d斷奶）是現(xiàn)代養(yǎng)豬的關(guān)鍵技術(shù)之一。但由于仔豬自身的發(fā)育特點及營養(yǎng)、環(huán)境和心理等應(yīng)激因素的綜合影響，極易誘發(fā)仔豬早期斷奶綜合征。研究證實，早期斷奶對仔豬免疫、內(nèi)分泌、消化器官均有嚴(yán)重的影響，尤其對胃腸道的形態(tài)、內(nèi)容物pH、消化酶活性、微生物區(qū)系等產(chǎn)生不利影響[1-6]。仔豬常表現(xiàn)出采食量低、消化不良、腹瀉、免疫力降低、發(fā)病率增高等癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。免疫應(yīng)激是導(dǎo)致仔豬早期斷奶綜合征的重要因素之一[8]。在“飼料禁抗、養(yǎng)殖減抗、產(chǎn)品無抗”的養(yǎng)殖背景下，尋找安全、有效的綠色替抗產(chǎn)品降低斷奶應(yīng)激對仔豬造成的傷害是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)迫切需要解決的問題。

研究證實中草藥添加劑可有效緩解仔豬斷奶應(yīng)激[9-13]。本試驗在研究復(fù)方中藥對早期斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血清激素水平、血清免疫球蛋白及腸黏膜免疫細(xì)胞影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其對早期斷奶仔豬血清細(xì)胞因子的影響，通過給仔豬注射大腸桿菌脂多糖（LPS）建立免疫應(yīng)激模型[14]，探討復(fù)方中藥對大腸桿菌LPS免疫應(yīng)激斷奶仔豬的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)試驗設(shè)計

選用48頭28日齡斷奶、體重相近的杜長大三元雜種仔豬，隨機(jī)分為4組。空白對照組：飼喂基礎(chǔ)飼糧，35日齡腹腔注射100 μg/kg體重的生理鹽水；中藥組：飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.3%中藥制劑，35日齡腹腔注射100 μg/kg體重的生理鹽水；內(nèi)毒素組：飼喂基礎(chǔ)飼糧，35日齡腹腔注射100 μg/kg體重的大腸桿菌LPS；中藥+內(nèi)毒素組：飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.3%中藥制劑，35日齡腹腔注射100 μg/kg體重的大腸桿菌LPS。

試驗期為14 d，于2015年8月16—29日在山西太原某豬場進(jìn)行。豬舍、飼養(yǎng)條件、衛(wèi)生環(huán)境、飼料品質(zhì)及其他飼養(yǎng)管理等均相同，試驗豬常規(guī)免疫，自由采食和飲水。試驗開始第7天采血進(jìn)行細(xì)胞因子測定。試驗開始第14天，稱重，觀察中藥對免疫應(yīng)激仔豬生長性能的影響，將另文報道。試驗基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.2 中藥制劑

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所中獸醫(yī)藥研究室負(fù)責(zé)中藥的選擇、組方。組方由茯苓乙醇提取物、魚腥草乙醇提取物、白頭翁乙醇提取物、白術(shù)乙醇提取物、麥冬乙醇提取物、黨參乙醇提取物、當(dāng)歸乙醇提取物、姜黃乙醇提取物、山楂水提取物、葡萄糖、蒙脫石等按一定比例組成；所有中藥均購自河北安國市祁瑞中藥材有限責(zé)任公司。

乙醇提取物的制備：將原料清洗干凈，放入提取罐中，加入9～10倍量體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，回流提取3次，每次分別為2 h、1 h、1 h，過濾，合并提取液；將提取液減壓回收乙醇，并濃縮至相對密度1.20～1.25，得提取物浸膏；提取物浸膏經(jīng)噴霧干燥機(jī)干燥即可。

水提取物的制備：將山楂粉碎成顆粒，加水浸泡1～3 h，加入原料8～12倍量水煎煮2～3次，過濾，合并煎煮液；將煎煮液減壓濃縮至相對密度1.20～1.25，噴霧干燥后得混合提取物。

1.3 LPS

大腸桿菌血清型055:B5，Sigma公司產(chǎn)品，注射時用生理鹽水配成含LPS 500 μg/mL的溶液。

1.4 血樣采集和血清制備

試驗開始第7天，LPS注射后3 h，從各組隨機(jī)選取6頭仔豬，前腔靜脈采血10 mL于離心管中，室溫下放置20 min，3 000 r/min離心10 min，吸取血清，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標(biāo)及方法

血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進(jìn)行測定；試劑盒均購自美國R＆D System。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA程序進(jìn)行方差分析和鄧肯氏（Duncan）多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

由表2可知，中藥組的白細(xì)胞介素-1β極顯著低于其它各組（P＜0.01）；內(nèi)毒素組的白細(xì)胞介素-1β極顯著高于其它各組（P＜0.01）；中藥+內(nèi)毒素組的白細(xì)胞介素-1β極顯著低于內(nèi)毒素組（P＜0.01），極顯著高于中藥組（P＜0.01），顯著高于空白對照組（P＜0.05）。中藥組的白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α與空白對照組差異不顯著（P＞0.05），極顯著低于內(nèi)毒素組和中藥+內(nèi)毒素組（P＜0.01）；內(nèi)毒素組的白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α極顯著高于其它各組（P＜0.01）；中藥+內(nèi)毒素組的白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α極顯著低于內(nèi)毒素組（P＜0.01），極顯著高于中藥組和空白對照組（P＜0.01）。

表2 中藥對LPS免疫應(yīng)激斷奶仔豬血清細(xì)胞因子的影響

3 討論

細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞因子的檢測在評價免疫狀態(tài)、探討免疫應(yīng)激發(fā)生機(jī)制及免疫的營養(yǎng)調(diào)控中都有重要意義[15-17]。IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子是炎癥細(xì)胞在炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其含量高低反映著炎癥反應(yīng)狀態(tài)[18]。免疫應(yīng)激指動物在受到能誘發(fā)免疫反應(yīng)的病原和非病原因素刺激時所出現(xiàn)的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)及由此而引起各種功能和代謝的改變[19]。研究表明，動物在發(fā)生免疫應(yīng)激反應(yīng)時，應(yīng)激原會刺激單核／巨噬細(xì)胞系統(tǒng)過量分泌，并釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子，這是引起免疫應(yīng)激動物生長抑制的主要原因[20]。本試驗采用腹腔注射大腸桿菌脂多糖（LPS）的方法模擬免疫應(yīng)激，測定復(fù)方中藥對注射大腸桿菌LPS后3 h細(xì)胞因子的變化。由試驗結(jié)果可知，腹腔注射大腸桿菌LPS后，斷奶仔豬血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量極顯著升高，說明其免疫系統(tǒng)被激活；中藥+內(nèi)毒素組的中藥制劑使斷奶仔豬血清中白細(xì)胞介素-1 β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的含量極顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果表明中藥制劑有抗內(nèi)毒素的作用，通過抑制免疫應(yīng)激所引起的細(xì)胞因子水平的上升，來減輕炎癥反應(yīng)對機(jī)體的損傷，有效緩解應(yīng)激反應(yīng)。