乙醇對(duì)右旋糖酐酶酶解作用的影響

問(wèn)清江，慕 娟，鄭巧霞，孫曉宇，丁 浩

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)為糖苷水解酶，能夠?qū)Ｒ恍缘厮庥倚囚?Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵，降解為小分子的右旋糖酐、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。右旋糖酐酶可用于齲齒的防治[1]。右旋糖酐酶用于制糖業(yè)，甘蔗汁中的污染微生物將蔗糖轉(zhuǎn)化為高黏度、高分子量的α-葡聚糖，影響生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)，右旋糖酐酶可以降解去除α-葡聚糖，使蔗糖生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)得以保證。右旋糖酐酶水解高分子右旋糖酐制備低分子藥用右旋糖酐，由于其具有專(zhuān)一性和高效性，可以提高水解效率，降低能耗，改善產(chǎn)品品質(zhì)?，F(xiàn)有的藥用右旋糖酐生產(chǎn)工藝是腸膜狀明串珠菌發(fā)酵將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡聚糖(右旋糖酐)，利用乙醇沉淀法從發(fā)酵液分離右旋糖酐(粗酐)，右旋糖酐沉淀經(jīng)鹽酸水解分離純化為一定分子量的藥用右旋糖酐產(chǎn)品。粗酐中有乙醇?xì)埩?，將右旋糖酐酶引入藥用右旋糖酐生產(chǎn)工藝中替代鹽酸水解高分子右旋糖酐，必須考慮粗酐中的殘留乙醇對(duì)右旋糖酐酶水解右旋糖酐的影響。通過(guò)對(duì)乙醇對(duì)右旋糖酐酶酶解反應(yīng)的影響、乙醇對(duì)右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響及不同濃度乙醇對(duì)右旋糖酐酶酶解右旋糖酐的影響等研究，為右旋糖酐酶應(yīng)用于右旋糖酐生產(chǎn)提供一定的技術(shù)數(shù)據(jù)和條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 右旋糖酐酶(寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.1.2 試劑 葡萄糖(D-(+)-Glucose),Sigma 公司產(chǎn)品；3,5-二硝基水楊酸(CP)；乙醇(AR)；其他試劑為市售分析純。

1.1.3 粗酐(陜西省微生物研究所自制)。

1.1.4 儀器 722分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；2010A-HT高效液相色譜儀(蘇州貝銳儀器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 乙醇對(duì)右旋糖酐酶解反應(yīng)的影響 在pH5.0，溫度50℃，時(shí)間10min的反應(yīng)條件下，分別以含有0、5%、10%、15%、20%、25%、30%不同濃度乙醇的1%的右旋糖酐作為底物進(jìn)行右旋糖酐酶解反應(yīng)，檢測(cè)水解液中的還原糖(以葡萄糖計(jì))，以確定乙醇對(duì)右旋糖酐酶解反應(yīng)的影響。

1.2.2 乙醇對(duì)右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響

1.2.2.1 在4℃條件下乙醇對(duì)右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響

以5%、10%、15%、20%、25%、30%不同乙醇濃度的溶液分別稀釋右旋糖酐酶(相同的稀釋倍數(shù))，將稀釋酶液放置4℃冰箱24 h，然后測(cè)定酶活。

1.2.2.2 乙醇對(duì)右旋糖酐酶熱穩(wěn)定性的影響

用2.5%、5.0%、7.5%、10.0%乙醇溶以相同的稀釋倍數(shù)液分別稀釋右旋糖酐酶，在50℃水浴保溫5h，每1h取樣檢測(cè)右旋糖酐酶活力，得出殘余酶活而確定乙醇濃度對(duì)右旋糖酐酶在50℃條件下穩(wěn)定性的影響。

1.2.3 乙醇對(duì)右旋糖酐酶解的影響 右旋糖酐酶在6%右旋糖酐濃度，50℃，乙醇含量分別為2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%和20.0%的條件下水解右旋糖酐，每隔30 min取樣檢測(cè)和旋糖酐分子量分布。水解結(jié)束后乙醇沉淀、50℃烘干，測(cè)定分子量分布。

1.2.4 右旋糖酐酶活力的測(cè)定[2]采用DNS法測(cè)定右旋糖酐酶活力。配制1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水補(bǔ)齊1 mL，再加入2 mLDNS，沸水浴2 min，流水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm測(cè)定光吸收值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程用于葡萄糖含量和右旋糖酐酶活力測(cè)定。將酶液用一定pH值的緩沖液適當(dāng)稀釋后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL1%的右旋糖酐溶液中，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入2 mLDNS終止反應(yīng)，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對(duì)照，0.5 mL1%的右旋糖酐溶液50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，先后加入2 mLDNS和0.5 mL的酶液，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL。以蒸餾水為對(duì)照測(cè)定540 nm的吸光值，樣品和空白對(duì)照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出反應(yīng)液中的葡萄糖量，從而確定酶活。酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘催化右旋糖酐產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(IU)。

1.2.5 分子量與分子量分布[3]取樣品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過(guò)夜作為供試品溶液。另取4～5個(gè)已知分子量的右旋糖酐對(duì)照品，依法檢測(cè)(2020版《藥典》二部附錄VH)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇對(duì)右旋糖酐酶作用的影響

在pH5.0，溫度50℃，時(shí)間10 min的反應(yīng)條件下，分別以含有5%、10%、15%、20%、25%、30%不同濃度乙醇的1%的右旋糖酐作為底物進(jìn)行右旋糖酐酶解反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖1。底物中乙醇濃度從5.0%～30.0%，右旋糖酐酶解液還原糖(以葡萄糖計(jì))的含量與不含乙醇的對(duì)照相比較，無(wú)明顯差異，說(shuō)明在這一反應(yīng)條件下，乙醇對(duì)右旋糖酐酶酶解反應(yīng)本身無(wú)影響。

圖1 乙醇對(duì)右旋糖酐酶作用的影響

2.2 乙醇對(duì)右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響

2.2.1 在4℃條件下乙醇對(duì)右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響 右旋糖酐酶在5%～30%乙醇溶液中，4℃放置24h后檢測(cè)其殘余酶活力(圖2)，不同濃度乙醇溶液中的殘余酶活力與對(duì)照相比較，均沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明在4℃條件下，右旋糖酐酶在5%～30%乙醇溶液中相對(duì)穩(wěn)定。

圖2 4℃條件下乙醇對(duì)右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響

2.2.2 乙醇對(duì)右旋糖酐酶熱穩(wěn)定性的影響 右旋糖酐酶用不同濃度的乙醇溶液稀釋20倍后放入50℃水浴保溫5 h，每隔1 h取樣檢測(cè)殘存酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。在1 h 取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)溶液中有沉淀產(chǎn)生，且隨著乙醇濃度的增加沉淀增多，在熱的乙醇溶液(50℃)中造成酶蛋白凝聚變性而失活，乙醇濃度越大，這種現(xiàn)象越嚴(yán)重。2.5%乙醇溶液中殘余酶活力隨時(shí)間降低的趨勢(shì)最緩，乙醇濃度增大變化加快，10.0%乙醇溶液中殘余酶活力降低最快。1 h時(shí)，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活殘存率分別為73.65%，62.67%，41.58%和31.13%，而無(wú)乙醇溶液中的酶活殘存率為93%[4]。5 h時(shí)，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活殘存率分別為43.83%，30.13%，22.46%和21.47%。在4℃的乙醇溶液(5%～30%)中沒(méi)有這種現(xiàn)象發(fā)生，說(shuō)明乙醇對(duì)右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性有影響，因此在用右旋糖酐酶降解右旋糖酐時(shí)必須考慮到這一點(diǎn)。

圖3 右旋糖酐酶在乙醇溶液中的熱穩(wěn)定性

2.3 乙醇對(duì)右旋糖酐酶解的影響

在右旋糖酐酶解時(shí)加入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%不同濃度的乙醇，水解進(jìn)程中取樣檢測(cè)右旋糖酐分子量的分布(圖4-圖7)。乙醇濃度為2.5%和5.0%的水解進(jìn)程與無(wú)乙醇相比較(圖4，圖6)，水解趨勢(shì)基本一致，2.5h的重均分子量分別為17 092和17 101，與無(wú)乙醇重均分子量12 025相比較，同處于10 000～20 000之間，說(shuō)明在乙醇含量5.0%以下對(duì)右旋糖酐的酶解影響較小。乙醇濃度為7.5%、10.0%、12.5%、15.0%時(shí)(圖4-7)，雖然重均分子量隨時(shí)間延長(zhǎng)降低，但水解度的差異顯現(xiàn)，2.5 h的重均分子量分別為26 050，26 929，25 351、26 416，與無(wú)乙醇重均分子量差距進(jìn)一步擴(kuò)大，表明乙醇濃度7.5%～15.0%對(duì)右旋糖酐酶解的影響處于一個(gè)水平，但與5.0%以下比較，影響明顯增大。乙醇濃度為17.5%和20.0%的降解速率明顯變慢(圖5)，水解度降低(圖6-圖7)，2.5 h的重均分子量分別為42 893和95 025，3.0 h的重均分子量分別為31 887和77 759，右旋糖酐酶解液中乙醇濃度為17.5%以上會(huì)對(duì)水解產(chǎn)生極強(qiáng)地影響。

圖4 不同乙醇濃度右旋糖酐酶解進(jìn)程(1)

圖5 不同乙醇濃度右旋糖酐酶解進(jìn)程(2)

圖6 2.5 h不同乙醇濃度水解液中右旋糖酐分子量分布

圖7 3.0 h不同乙醇濃度水解液中右旋糖酐分子量分布

在2.1中右旋糖酐酶酶解反應(yīng)是底物和酶液分別為0.5 mL，酶解液中的乙醇含量實(shí)際是2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%、15.0%，反應(yīng)時(shí)間10 min，在這樣的條件下盡可能避免了右旋糖酐酶在50℃乙醇溶液中凝聚變性活力受損，底物中乙醇濃度在30%以下對(duì)右旋糖酐酶作用本身基本沒(méi)有影響，乙醇不影響右旋糖酐酶的作用。在2.1中，低溫(4℃)下30%以下的乙醇溶液對(duì)右旋糖酐酶的穩(wěn)定性不會(huì)產(chǎn)生影響，但是在50℃，2.5%乙醇溶液中右旋糖酐酶在1h時(shí)酶蛋白凝聚沉淀產(chǎn)生使酶活力受損，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，沉淀增加，活力受損增加，隨著乙醇濃度的增加，右旋糖酐酶活力隨時(shí)加劇，因此在單純的乙醇溶液中，右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性較差。不同乙醇濃度條件下的右旋糖酐酶解結(jié)果表明，2.5%～20.0%乙醇含量雖然不同程度的影響到酶解，但是在相對(duì)應(yīng)的乙醇濃度下沒(méi)有單純乙醇溶液中酶活損失而產(chǎn)生的影響大，原因在于，有右旋糖酐的存在，抑制了酶蛋白凝聚變性的產(chǎn)生，減少了右旋糖酐酶活力受損的速率和強(qiáng)度。乙醇對(duì)右旋糖酐酶解的影響因乙醇濃度的不同而不同，5.0%以下影響較小，7.5%～15.0%影響在同一的水平，17.5%以上影響加劇。因此，在右旋糖酐酶解工藝過(guò)程中，乙醇對(duì)右旋糖酐的酶解的影響是可控制的。

3 討論

現(xiàn)有的右旋糖酐原料藥生產(chǎn)工藝是將高分子的右旋糖酐從右旋糖酐發(fā)酵液中用乙醇沉淀分離為粗酐，沉淀直接溶解為一定濃度的右旋糖酐溶液，加入鹽酸水解為一定分子量分布的低分子右旋糖酐，乙醇分離純化為目標(biāo)分子量分布的藥用右旋糖酐。由于粗酐沒(méi)有干燥，一定有乙醇?xì)埓?，生產(chǎn)企業(yè)的實(shí)際情況是發(fā)酵水平高低、分離提取等因素導(dǎo)致粗酐乙醇?xì)埩舾叩筒煌?，表現(xiàn)在右旋糖酐水解液中乙醇含量在1.0%～15.0%之間，因此在水解工藝中引入右旋糖酐酶代替鹽酸，必須考慮殘留乙醇對(duì)右旋糖酐酶作用的影響。在2.1中的反應(yīng)條件下，底物中乙醇濃度從5.0%～30.0%的右旋糖酐酶酶解反應(yīng)表明，右旋糖酐溶液中乙醇含量30.0%以下對(duì)右旋糖酐酶酶解反應(yīng)本身無(wú)影響。低溫(4℃)條件下，右旋糖酐酶在30%以下的乙醇溶液中相對(duì)穩(wěn)定。在熱的乙醇溶液(50℃)中造成酶蛋白凝聚變性而失活，乙醇濃度越大，這種現(xiàn)象越嚴(yán)重，不同的乙醇濃度，右旋糖酐酶活力損失不同，1 h時(shí)，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活殘存率分別為73.65%，62.67%，41.58%和31.13%，5 h時(shí)，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活殘存率分別為43.83%，30.13%，22.46%和21.47%。乙醇對(duì)右旋糖酐的酶解影響結(jié)果表明，不同乙醇含量影響不同，右旋糖酐酶解液中乙醇含量5%下影響甚微，7.5%～15.0%影響進(jìn)一步增大，但基本維持在同一的水平，17.5%以上影響劇烈，因此需要在右旋糖酐酶解時(shí)根據(jù)粗酐乙醇?xì)埩舨煌?，采用不同的工藝條件參數(shù)，同時(shí)需要加強(qiáng)發(fā)酵等上游工藝條件控制，盡可能的使粗酐中的乙醇?xì)埩舴€(wěn)定在一定范圍，從而保證右旋糖酐的酶解。右旋糖酐酶替代鹽酸水解右旋糖酐生產(chǎn)右旋糖酐原料藥，雖然粗酐中的乙醇?xì)埩魰?huì)影響右旋糖酐酶的作用，但是是可以控制的。畢竟右旋糖酐酶具有的專(zhuān)一性、高效性等特點(diǎn)，使得右旋糖酐水解溫度從90～95℃降低到50℃，大大降低能耗，不增加原材料的費(fèi)用，避免了鹽酸使用對(duì)設(shè)備的特殊要求和環(huán)保負(fù)荷，改善產(chǎn)品品質(zhì)?？傊倚囚赣糜谟倚囚纤幍纳a(chǎn)具有良好的前景。