植物小孢子培養(yǎng)技術研究進展

肖婉露，馬培芳,2，張 偉,2，王繼蕓,2，張國娜,2，蔣欽群，李紀軍,2

(1.平頂山市農(nóng)業(yè)科學院 河南 平頂山 467001；2.河南省韭菜工程技術研究中心 河南 平頂山 467001)

農(nóng)作物及果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展都依賴于高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種，而常規(guī)的雜交育種法往往需要親本雜交之后再通過6～8代的回交和定向篩選才能實現(xiàn)優(yōu)良性狀的遺傳改良。利用孤雌生殖、孤雄生殖或者無配子生殖產(chǎn)生單倍體再經(jīng)過染色體加倍恢復育性的單倍體育種技術則可以直接獲得優(yōu)良純合個體，可以大大縮短育種進程[1]。然而，單倍體的自然發(fā)生率只有0.05%～0.1%[2]，所以通過人工干預獲得單倍體是實際育種中常用的方法。自從Guha和Maheshwari[3]首次發(fā)現(xiàn)花粉粒可以脫離正常配子體途徑轉向孢子體發(fā)育途徑并在體外誘導胚狀體后產(chǎn)生單倍體植株后，小孢子培養(yǎng)技術逐漸發(fā)展起來。目前該技術已經(jīng)在小麥、玉米、辣椒、白菜、茄子等作物中廣泛應用，在果樹中應用還比較少，僅在油橄欖[4]、柑橘[5]等少量物種中有相關報道。這一技術的推廣很大程度上受到育種材料基因型和技術體系成熟度的限制。本文結合目前植物小孢子的研究現(xiàn)狀，綜述了影響小孢子培養(yǎng)的主要因素進行以及小孢子培養(yǎng)技術面臨的問題和對未來的展望。

1 小孢子培養(yǎng)技術原理及應用

植物小孢子培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)都是常用的單倍體育種方法。小孢子培養(yǎng)是通過直接從花蕾或者花藥中分離新鮮的小孢子，通過組織培養(yǎng)技術，采用適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，誘導產(chǎn)生胚狀體從而獲得單倍體植株，再通過技術手段使染色體加倍，獲得純合可育的雙單倍體(DH)的過程。與花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)可以排除花藥壁和絨氈層細胞的干擾，保證所獲得的植株是小孢子發(fā)育所得。小孢子培養(yǎng)所得良后代性狀不分離，且表現(xiàn)整齊一致，明顯縮短了育種年限。作為遺傳工程中的一個工具，小孢子培養(yǎng)技術還可用于與遠緣雜交相結合創(chuàng)制育種新材料、進行抗病、抗逆種質(zhì)的篩選、與誘變技術相結合創(chuàng)制突變體、用于遺傳作圖等方面[6～8]。

2 小孢子胚狀體誘導的主要影響因素

2.1 供體植株的基因型

基因型是影響小孢子出胚率的最重要因素之一，這不僅體現(xiàn)在物種間，物種內(nèi)也有所體現(xiàn)[9]。姚悅海對12個羽衣甘藍品種進行小孢子培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，其中有1個品種不能誘導出胚狀體，其它11個品種的出胚數(shù)最小值和最大值則分別為0.94和11.84[10]。趙艷艷在對10個菜心品種進行小孢子培養(yǎng)優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)只有3個品種獲得了胚狀體[11]。Pawel Nowaczyk[12]還發(fā)現(xiàn)，胚狀體誘導率差異較大的兩種基因型的母本雜交后產(chǎn)生的F1代，誘導率處于二者之間，吳藝飛進行紅菜薹小孢子培養(yǎng)技術研究時，也得出同樣的結論[13]。這一發(fā)現(xiàn)，可以通過優(yōu)化小孢子培養(yǎng)條件，嘗試用小孢子產(chǎn)胚率高的品種與產(chǎn)胚率低的品種雜交來突破基因型對小孢子培養(yǎng)的限制。

2.2 小孢子發(fā)育時期

理論上講，小孢子各個發(fā)育階段都具有全能性。但是在實際離體培養(yǎng)的過程中，不同時期的小孢子誘導產(chǎn)生胚狀體的能力是有很大差別的，這在不同的物種以及同一物種的不同基因型之間都有所體現(xiàn)。目前已報道可成功誘導胚狀體的植物中大多是處在小孢子單核靠邊期至雙核早期時誘導效果最佳[14～15]。小孢子的發(fā)育時期又和花蕾的外部形態(tài)、花藥的顏色等相關聯(lián)。湯泳萍在對蘆筍小孢子培養(yǎng)研究時，發(fā)現(xiàn)花蕾縱徑在2.099～2.284 mm，花蕾橫徑1.749～1.891 mm，花藥長度1.149～1.225 mm，是小孢子培養(yǎng)最佳發(fā)育時期，此時小孢子正處于單核靠邊期[16]。陳琛做了胡麻花蕾大小與小孢子發(fā)育時期的相關性研究，發(fā)現(xiàn)胡麻花蕾的不同長度也對應小孢子發(fā)育的不同時期[17]。據(jù)此，可以根據(jù)花蕾或者花藥的形態(tài)來挑選最佳發(fā)育時期的小孢子進行培養(yǎng)。

2.3 預處理

預處理是誘導小孢子由配子體發(fā)育轉向孢子體發(fā)育的重要因素之一。常用的方法包括熱激處理、低溫處理、鹽處理等。預處理的目的在于人為地改變小孢子的內(nèi)在狀態(tài)，從而誘導小孢子轉入孢子體發(fā)育[18]。4℃低溫預處理24～48 h及33～34℃高溫熱激24～48 h都能有效促進葉用芥菜誘導產(chǎn)生胚狀體[19]。32℃預處理2 d能夠提高水稻小孢子的愈傷產(chǎn)量和綠苗率，離體穗低溫處理21 d促進大麥游離小孢子產(chǎn)生胚狀體效果最佳，同時10 mg·L-1秋水仙堿預處理也能明顯提高水稻小孢子的愈傷產(chǎn)量[20]。在大麥花萌發(fā)期和小孢子期分別用15 g·L-1和0.3 g·L-1的NaCl溶液進行預處理后，能夠顯著提高小孢子愈傷產(chǎn)量[21]。范適還發(fā)現(xiàn)僅低溫預處理的茄子小孢子不能啟動小孢子脫分化，但是在低溫處理一定時間后再進行熱激處理則能極大提高小孢子胚狀體的誘導頻率[22]。因此不同的植物要通過試驗來選擇其適宜的預處理方法來提高小孢子誘導頻率。

2.4 誘導培養(yǎng)基組分和激素

目前用于小孢子誘導的培養(yǎng)基有NLN、B5、MS、N6等，其中MS培養(yǎng)基含有較高濃度的無機鹽，B5的銨濃度較低，N6多用于禾谷類。對于不同的物種需要調(diào)節(jié)碳源、氮源、pH值等條件來找出最適宜的配方。有研究表明把NLN培養(yǎng)基的蔗糖濃度調(diào)節(jié)至13%，在多種十字花科植物小孢子培養(yǎng)中能達到最佳效果[23～24]。大部分的誘導培養(yǎng)基中還需要添加一定的激素作為誘導劑來促進小孢子發(fā)育為胚狀體，激素的配比及濃度是提高胚狀體誘導成功率主要因素之一，常用的激素有NAA、6-BA、ZT等。不同的物種適宜的基本培養(yǎng)基及激素不同。蕪菁小孢子有最佳誘導效果的是基本培養(yǎng)基中添加0.05 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA對有最佳的誘導效果[23]。誘導菜心小孢子時，在蔗糖濃度100 g·L-1的NLN中添加0.1 mg·L-16-BA和NAA效果最佳[25]。在改良過的N6培養(yǎng)基中添加1.5～2.0 mg·L-1的2，4-D則能有效優(yōu)化大麥小孢子高頻再生體系[26]。此外，高素燕對32個不同基因型的辣椒進行小孢子誘導胚狀體時，還發(fā)現(xiàn)同樣的物種中不同的基因型適宜添加的激素濃度也是有所差異的[27]。不過也有研究顯示，有些基因型不添加激素就可以成功誘導胚狀體，添加激素反而會降低出胚率甚至不出胚，而且可能會胚畸形[28]。所以在實際的育種試驗中要先篩選出適合該基因型的基本培養(yǎng)基，然后再參考植株再生所用的激素進行不同的配比試驗，優(yōu)化小孢子培養(yǎng)體系。

2.5 外源添加物

培養(yǎng)基中的外源添加物在胚誘導中不是決定性因素，但是會影響小孢子胚誘導頻率。其中活性炭是常用的一種添加物。許多研究表明小孢子培養(yǎng)過程中添加會產(chǎn)生酚類等有害物質(zhì)，會降低胚狀體的發(fā)生頻率。天然吸附劑活性炭常被用于吸附這類有害物質(zhì)。王葆生的研究表明，添加活性炭有利于胡蘿卜小孢子胚的誘導，最佳濃度為0.2 g·L-1[29]。有些植物中，由于不同品種在培養(yǎng)過程中釋放有害物量不同，所以活性炭產(chǎn)生的效果有所差異[30]。也有研究表明活性炭在小孢子培養(yǎng)中是必須的，但是不同濃度的活性炭對總胚狀體的產(chǎn)量影響沒有顯著差異[31]。此外，也有研究低濃度的AgNO3[32]以及一定濃度的氨基酸類添加物[33]也有利于小孢子胚狀體誘導。

2.6 植株組織共培養(yǎng)

植物花藥壁、子房等組織與小孢子共培養(yǎng)也是影響小孢子胚狀體的誘導頻率的因素之一，在許植物中都已經(jīng)證實了這個結論。小麥誘導培養(yǎng)基中加入未成熟的小麥子房與小孢子共培養(yǎng)，可以顯著提高胚狀體的質(zhì)量，增加胚狀體誘導率和植株再生能力[34]。花藥壁組織與小孢子共培養(yǎng)能顯著提高茄子小孢子胚狀體的誘導頻率[22]。Lantos等[35]利用小麥或辣椒子房共培養(yǎng)方式誘導辣椒胚狀體，發(fā)現(xiàn)小麥子房共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生胚狀體，誘導效果甚至優(yōu)于辣椒子房共培養(yǎng)。子房和花藥壁組織促進小孢子胚誘導的機理，目前還無定論，有學者猜測可能是因為子房在小孢子誘導過程中會釋放一些含有PAA或者類似物及某些氨基酸類營養(yǎng)物質(zhì)[36]。

3 胚狀體再生

胚狀體分化成植株是小孢子培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)之一。該階段主要的影響因素是培養(yǎng)基組分。一般的做法是參考適宜于供試材料的分化培養(yǎng)基組分，通過對激素濃度、碳源成分、pH值等條件調(diào)節(jié)進行改良。梁超凡研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)MS培養(yǎng)基+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA+活性炭1 mg·L-1+蔗糖濃度為3%+瓊脂濃度為1.2%)能夠簡單有效地誘導不接球白菜小孢子胚狀體發(fā)育成植株[37]，不定芽成苗MS培養(yǎng)基中添加5μmol·L-1MT和0.1 mg·L-1NAA與對照相比能顯著性地促進甘藍DH植株生根和快速健壯生長[38]。培養(yǎng)基中的添加物也會對成苗率有較大的影響。有研究表明添加亞甲藍能將大白菜小孢子形成胚狀體的成苗率提高1.40～1.67倍[39]。王玉書在做羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)子葉形胚植株再生頻率顯著高于其它類型的胚，心形胚、球形胚和畸形胚只有很小一部分能發(fā)育形成植株[40]，一些研究也表明胚齡的長短及轉分化的時間也是影響胚狀體成苗的一個主要原因[41]。此外，胚狀體發(fā)育的其它外部條件，如溫度、光照、通氣條件等也會對小孢子胚狀體再生植株產(chǎn)生一定的影響。

4 問題與展望

目前小孢子培養(yǎng)技術在十字花科、禾本科植物中應用較為成熟，在大白菜、甘藍、菜心、小麥等植物中都建立了完整的培養(yǎng)體系。但是其他的作物以及木本植物中誘導成功的相關報道還比較少，魏凌鶴對柑橘進行花藥和小孢子培養(yǎng)創(chuàng)制單倍體時，花藥培養(yǎng)可以成功誘導胚狀體，而小孢子培養(yǎng)始終沒有成功[5]。一些植物小孢子可以成功誘導成胚胎發(fā)育，但是誘導出的胚狀體發(fā)育能力較差，再生植株成功率低[42]。雖然目前也有一些研究從胚胎發(fā)生的細胞形態(tài)學、代謝水平、分子水平等方面探究了小孢子胚胎發(fā)生機制，但是小孢子孢子體發(fā)育的誘導機制、啟動機制尚不明確。今后應著重以下幾方面的工作：

(1)參考已經(jīng)建立的技術體系，對其它植物進行誘導條件的優(yōu)化和嘗試，使小孢子培養(yǎng)技術更廣泛的應用。

(2)基因型影響小孢子培養(yǎng)的最關鍵因素，但差異是由哪些基因控制,其細胞結構、生理生化指標及基因表達是否有差異,培養(yǎng)技術改良是否要依據(jù)基因型差異而改變等方面需要進一步研究。結合轉基因組進一步揭示小孢子胚發(fā)生的分子機制。

(3)外界條件能夠誘導小孢子向孢子途徑發(fā)育，但是可誘導胚胎發(fā)生的外界條件在不同的物種甚至同一物種的不同基因型之間都有很大的差異。小孢子改變配子體向孢子體發(fā)育的的途徑受到什么調(diào)控，轉向孢子體發(fā)育后生理生化會有什么變化，二者之間是否存在什么聯(lián)系，這些問題都需要進一步論證。