基于Nrf2信號通路探討刺梨對過度訓練大鼠骨骼肌氧化應激損傷保護的機制

張帥軍 唐月 張大 杜旭輝 張錦

摘要：目的：探討刺梨介導核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路對過度訓練大鼠骨骼肌氧化應激損傷防護的分子機制。方法：SPF級SD大鼠45只，隨機分為安靜對照組（C組），大強度運動組（HT組）、低劑量刺梨大強度運動組（L-HT組）、高劑量刺梨大強度運動組（H-HT組）。以跑臺運動創建過度訓練模型，L-HT、H-HT組分別以100 g/kg/d和200 g/kg/d的劑量灌胃刺梨原液，C組、HT組灌胃等劑量的生理鹽水，6周大強度跑臺運動，運動結束后次日處死，取血清和腓腸肌，分別測定各組大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的水平、組織中Nrf2通路相關蛋白Nrf2、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）、血紅素氧合酶1（HO-1）和凋亡蛋白B淋巴細胞瘤因子-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）的相對表達水平（/SymbolbA@-actin）。 結果：1）與C組相比，HT組血清中GSH濃度降低、SOD活性下降以及MDA含量增多（P<0.01），組織中Nrf2通路相關蛋白Nrf2表達水平降低（P<0.05），Keap1沒有顯著性差異（P>0.05）、HO-1表達水平下降（P<0.05），Bcl-2表達水平下降（P<0.05），Bax表達升高（P<0.05），Bcl-2/Bax值下降（P<0.05）。2）與HT組相比，L-HT、H-HT組血清中GSH濃度上升、SOD活性增強以及MDA含量降低（P<0.05或P<0.01），組織中Nrf2通路相關蛋白Nrf2、HO-1表達水平升高（P<0.05或P<0.01），Keap1表達水平沒有明顯變化（P>0.05），Bcl-2表達水平升高（P<0.05），Bax表達下降（P<0.05），Bcl-2/Bax值增加（P<0.05）。結論：補充刺梨可介導Nrf2信號通路上調Nrf2、HO-1蛋白的表達，發揮抗氧化應激作用，進而緩解過度訓練所致的大鼠骨骼肌氧化應激和過度凋亡，保護骨骼肌結構或功能的穩定。

關鍵詞：刺梨;過度訓練;Nrf2信號通路;氧化應激

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2021）03-0097-08

Protection mechanism of rosa roxburgh against oxidative stress injury of skeletal muscle in overtraining rats based on Nrf2 signal pathway

ZHANG Shuaijun1， TANG Yuemei1， ZHANG Dading1， DU Xuhui2， ZHANG Jin2

1.College of Science and Technology，Gannan Normal University， Ganzhou 341000， Jiangxi; 2. The First People's Hospital of Pingdingshan， Pingdingshan 467000， Henan， China

Abstract：Objective： To explore the molecular mechanism of rosa roxburgh mediated nuclear factor E2-related factor 2 （NRF 2） signaling pathway in protecting skeletal muscle from oxidative stress injury in overtrained rats. Methods： 45 SPF SD rats were randomly divided into quiet control group （C group）， high intensity exercise group （HT group）， low-dose Rosa high intensive exercise group （L-HT group） and high-dose rosa high intensive exercise group （H-HT group）. The overtraining model was established by treadmill exercise. The L-HT and H-HT groups were given 100g/kg/d and 200g/kg/d of rosa stock solution respectively， and the C and HT groups were given the same dose of physiological saline. After 6 weeks of intensive treadmill exercise， they were killed the next day after exercise， and serum and gastrocnemius were collected. The levels of superoxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA） in serum， Nrf2 pathway related protein， Kelch-like epichlorohydrin related protein -1（Keap1）， heme oxygenase-1（HO-1）， apoptosis protein B lymphocyte tumor factor -2（Bcl-2） and Bcl-2 related X protein in tissues were measured respectively Results： 1） Compared with group C， the concentration of GSH in serum， SOD activity and MDA content in HT group decreased （P<0.01）， and the expression level of Nrf2 pathway related protein in tissues decreased （P<0.05）， but there was no significant difference in Keap1 （P>0.05）， HO-1 expression level decreased （P<0.05），Bcl-2 expression level decreased （P<0.05）; Bax expression level increased （P < 0.05）; Bcl-2/Bax expression level increased （P<0.05）. 2） Compared with HT group， GSH concentration in serum， SOD activity and MDA content in L-HT and H-HT groups increased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression level of Nrf2 and HO-1 in tissues increased （P<0.05 or P<0.01）， but the expression level of Keap1 did not change significantly （P>0.05）. Conclusion： Supplementing rosa roxburgh can mediate Nrf2 signaling pathway to up-regulate the expression of Nrf2 and HO-1 proteins and exert the effect of anti-oxidative stress， thereby alleviating oxidative stress and excessive apoptosis in rat skeletal muscle caused by over-training， and protecting the stability of skeletal muscle structure or function.

Key words：rosa roxburgh; overtraining; Nrf2 signal pathway; oxidative stress

氧化應激（Oxidative Stress，OS）是體內氧化與抗氧化失衡的一種狀態，是因自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）及其代謝物增加或抗氧化機制減弱而引起炎癥反應。氧化應激下，組織細胞內的核酸、蛋白質和脂質等生物分子交聯、滅活引起膜損傷以及一些生理生化過程的紊亂。刺梨（Rosa）系薔薇科落葉灌木植物，別名繅絲花、送春歸等，盛產于我國西南省區，刺梨果富含維生素C、大量維生素B1、B2、E、K等多種微量元素和SOD以及多糖、酸類、酚類和黃酮類衍生物等，具有抗炎癥、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和提升免疫能力等多種功能。隨著對刺梨開發研究的深入，刺梨在食品和藥品等方面的重要性越來越凸出，其抗氧化性、抗炎癥的功能成為近幾年來研究的熱點之一。對近年來刺梨研究的成果進行收集整理，發現其抗氧化和抗炎癥的研究幾乎都是從其所含營養成分方面進行的，而通過信號途徑研究刺梨抗氧化應激的文章屈指可數，說明在細胞信號途徑方面還存在著明顯不足。Nrf2信號通路是迄今為止發現最為重要的內源性抗氧化應激通路，對細胞代謝活動起重要調節作用，參與組織細胞抗氧化炎癥、衰老、凋亡等病例生理過程。因此本研究擬通過建立過度訓練的大鼠模型，通過不同劑量的刺梨補劑，檢測血清中氧化與抗氧化應激指標，并結合組織內Nrf2信號通路相關蛋白表達以及凋亡水平，探討刺梨介導Nrf2信號通路對過度訓練所致的骨骼肌氧化應激損傷的保護機制，以期為刺梨作為食品抗氧化劑或運動功能性食品的進一步開發提供理論依據。

1材料與方法

1.1動物、材料與試劑

SPF級SD大鼠45只（3月齡），體質量（236.78±1.21）g，購自江西中醫藥大學動物實驗中心，生產許可證號：SCXK（贛）2018-0003，飼養于（22±2）℃、相對濕度（60±5）的環境中，自由飲食，喂食國家標準嚙齒類動物飼料，飲用蒸餾水，正常晝夜節律。

刺梨，采用貴州天刺力食品科技有限責任公司生產的精制刺梨原液。

SOD試劑盒（50T/24S）、GSH試劑盒（100T/96S）、MDA試劑盒（100T/96S）;HO-1（48T）、Keap1（96T）、Bcl-2（48T）、Bax（48T）試劑盒;磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、放射免疫沉淀法裂解緩沖液（Radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA裂解液）、哺乳動物組織總蛋白提取試劑盒（AR0146）、RNA提取試劑盒、cDNA轉錄試劑盒（Tip Green qPCR Super Mix）、熒光定量試劑盒（RR820A）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白緩沖液5x（AR1112）、5牛血清白蛋白封閉液（Bovine serum albumin，BSA，AR0004）、增強型化學發光（Enhanced chemiluminescent，ECL）底物（AR1170）、硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membrane，NC）、兔抗大鼠Nrf2抗體（sc-722）、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（BA2913）、辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）-羊抗兔IgG（BA1054）。

1.2儀器與設備

JD-PT動物實驗跑臺（上海繼德教學實驗器械廠），CL-H120電子天平（上海亞津電子科技有限公司），TGL-16G-A低溫高速離心機（上海安亭化學儀器有限公司），TENLIN-C型電動勻漿器（江蘇天翎公司），EYELA振蕩器MMS-120H（杭州恒流科技有限公司），FD-1型冷凍干燥機（北京博醫康技術公司），LD-96A酶標儀、萊恩德熒光定量PCR反應儀（山東萊恩德智能科技有限公司公司），UC0102核酸擴增儀（杭州優思達生物技術有限公司），KH-Q320型切片機（湖北孝感闊海醫療科技有限公司），YKY-1100型熒光顯微鏡（基恩士 （中國） 有限公司），SP-9CA型生物顯微鏡（上海光學儀器廠），WD-9413B型凝膠成像分析系統、DYCZ-40K轉印電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1灌胃溶液的配制

刺梨精制原液純度為98，參考何誠動物實驗學動物灌胃的標準，大鼠灌胃劑量按照200 mg/kg/d的標準以10 ml/kg灌胃。

1.3.2動物模型的建立

45只SD大鼠，隨機選取8只作為安靜對照組（C組，8只），剩余37只以10 m/min，坡度0°，10 min/d的運動負荷進行篩選，剔除運動能力較差的大鼠4只，將剩余33只大鼠隨機分為大強度運動組（HT組，11只）、低劑量刺梨大強度運動組（L-HT組，11只）、高劑量刺梨大強度運動組（H-HT組，11只）。實驗過程中，由于訓練強度過大以及其他原因，造成運動大鼠的部分死亡，最終C組8只，HT組7只，L-HT組10只，H-HT組10只。L-HT、H-HT組分別以100 g/kg/d和200 g/kg/d的劑量灌胃刺梨精制原液，C組、HT組每天以等體積的生理鹽水灌胃，每天運動前2 h灌胃一次，干預6周。運動方案采用改良后的6周遞增負荷跑臺訓練，具體方案如表1所示。

1.3.3血液標本采集和骨骼肌組織的提取

6周末次運動后，次日上午10：00各組大鼠用10的巴比妥腹腔注射麻醉，尾靜脈取血3 ml，置于抗凝管內，4℃、3 000 r/min，離心10 min，分離血清，分裝置于-20℃冰箱保存待測。斷頭處死各組大鼠，即刻取腓腸肌，置于冰浴中，剔除脂肪及周圍的結締組織，用預冷的生理鹽水沖洗血漬，待濾紙吸干后，各組用電子天平稱重1g，按照1∶4的比例（肌肉質量（g）：PBS體積（mL）=1∶4的比例加入PBS介質）用眼科剪剪碎置于玻璃勻漿管，加入4 ml勻漿介質，電動勻漿器勻漿，4℃、6 000 r/min、10 min，取上清液標記分裝，置于-80℃冰箱保存。

1.4指標測試

1.4.1大鼠血清中氧化應激指標的測定

取待測血清，測定血清中氧化應激指標變化。微量酶標法測定GSH的濃度，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活性，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明步驟進行測試。

1.4.2大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關蛋白表達的測定

取待測組織液，在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑，振蕩器搖勻置于冰水浴中沉淀。用二辛可寧酸 （bicinchonininc acid，BCA）法測各組待測液蛋白濃度，并稀釋至相同濃度，蛋白定量后加入上述混合液，100℃煮沸5 min，按照4∶1的體積比例加入SDS-PAGE蛋白上清液5 x，分離樣品并轉膜，用TBST洗滌3次后，用牛清蛋白封閉2 h，再用TBST洗滌3次，加入二抗后在室溫下孵育，用TBST洗脫二抗，用ECL試劑顯影，以β-actin為內參，制作電泳凝膠，用Western印跡法測定組織中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白的相對表達水平，用WD-9413型凝膠成像系統進行顯影。

1.4.3骨骼肌組織Nrf2信號通路中細胞凋亡相關蛋白的測定

取待測組織液，在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑，搖勻置于冰水浴中沉淀。用Trizole法提取組織液中總RNA，每個樣本以2 μgRNA作為初始模板，反應條件：37℃、15 min，85℃、5 min，4℃、10 min保持。以合成的cDNA為模板，以β-actin為內參，配置20 μl的總反應體系，每個樣本檢測3個復孔，用實時熒光定量PCR系統進行熒光定量，反應條件為預變性95℃、30 s，PCR反應95℃、5 s， 60℃、30 s，40個循環。根據基因序列設計特異性引物，應用cDNA合成試劑盒在核酸擴增儀上進行反轉錄成cDNA，進行RT-PCR檢測細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達，以2-△△Ct進行數據分析。基因引物序列如表2所示。

1.5數據處理與分析

實驗數據以x±s表示，采用SPSS20.0軟件進行數據分析，組間差異使用單因素方差分析（One way ANOVA），實驗用GraphPad Prism8.0軟件繪圖分析，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為異常顯著性差異。

2實驗結果與分析

2.1大鼠血清中氧化應激指標的測定

正常機體存在著各種抗氧化酶（SOD、CTA、GSH-PX）、小分子抗氧化劑（GSH、VC、VE）等，形成了重要的防御體系以對抗ROS的損傷。通過對各組大鼠骨骼肌組織中GSH濃度、SOD活性以及 MDA含量的檢測，結果顯示，與C組相比，HT組GSH濃度降低、SOD活性下降以及MDA含量增多等都呈現異常顯著性差異 （P<0.01）;與HT組相比，L-HT組GSH濃度上升、SOD活性增強以及MDA含量降低等都呈現顯著性差異 （P<0.05），H-HT組GSH濃度增高、SOD活性增強以及MDA含量降低等呈現異常顯著性差異 （P<0.01）;與L-HT組相比，H-HT組SOD活性增強以及MDA含量降低等呈現異常顯著性差異（P<0.01）， GSH濃度沒有統計學差異（P>0.05），見表3。

2.2大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關蛋白表達的測定

Nrf2是Nrf2信號通路抗氧化應激反應的關鍵轉錄因子，氧化應激下，調控Nrf2和Keap1的結合態，實現抗氧化酶的表達。通過對各組大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、Keap1和HO-1的檢測，結果顯示，與C組相比，HT組Nrf2表達水平降低具有顯著性差異（P<0.05），Keap1表達水平沒有統計學差異 （P>0.05），HO-1表達水平降低有顯著性差異（P<0.05）;與HT組相比，L-HT組Nrf2表達水平升高有顯著性差異（P<0.05），Keap1表達水平沒有顯著性差異（P>0.05），HO-1表達水平升高有顯著性差異（P<0.05）;H-HT組Nrf2表達水平升高有異常顯著性差異（P<0.01），Keap1表達變化沒有統計學差異（P>0.05），HO-1表達水平升高有異常顯著性差異（P<0.01）;與L-HT組相比，H-HT組Nrf2表達水平升高有顯著性差異（P<0.05），Keap1表達水平沒有統計學差異（P>0.05），HO-1表達水平升高有顯著性差異（P<0.05）（見圖1）。

2.3大鼠骨骼肌組織中細胞凋亡相關蛋白的測定

細胞凋亡是多因素、多階段和多基因嚴格控制的過程，涉及到誘導凋亡相關因素作用下啟動信號轉導，凋亡相關基因接受死亡信息后按預定程序啟動合成執行凋亡所需的多種酶，通過級聯反應降解底物，出現凋亡特征性的形態和生化改變。Bcl-2家族蛋白被視為調節細胞凋亡的開關，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax之間的相互作用，決定了細胞死亡的閾值。通過對各組大鼠骨骼肌組織中細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax值的檢測，結果顯示，與C組相比，HT組Bcl-2表達水平下降，呈現異常顯著性差異（P<0.01），Bax表達升高，呈現異常顯著性差異（P<0.01），Bcl-2/Bax值下降，呈現異常顯著性差異（P<0.01）;與HT組相比，L-HT組Bcl-2表達水平升高呈現顯著差異性（P<0.05），Bax表達降低呈現顯著差異性（P<0.05），Bcl-2/Bax值增加，有顯著差異性（P<0.05）;H-HT組Bcl-2表達水平升高呈現異常顯著性差異（P<0.01），Bax表達降低呈現顯著差異性（P<0.01），Bcl-2/Bax值升高有異常顯著性差異（P<0.01），與L-HT組相比，H-HT組Bcl-2、Bax表達水平沒有統計學差異（P<0.01），Bcl-2/Bax值升高有顯著性差異（P<0.05）（見圖2）。

3討論

3.1過度訓練對大鼠骨骼肌氧化應激損傷的影響

應激是指機體在受到一定強度的刺激作用時，所出現的全身性非特異性適應反應。生理狀態下，體內自由基的生成保持在低濃度動態平衡之中。SOD是生物體內對抗氧自由基最重要的抗氧化酶，研究證實SOD活性越高，機體抗氧化能力就越強。韓春華等研究表明，急性運動組大鼠骨骼肌線粒體內ROS水平及SOD量與對照組相比明顯升高。MDA是含雙鍵的脂肪酸過氧化生成的產物，能與蛋白質、磷脂和核酸的胺交聯和聚合，產生過氧化連鎖反應。機體內MDA的量與脂質過氧化成正相關，測定MDA含量可間接反應運動時自由基的生成及其毒性作用的程度。高超等研究顯示，急性運動訓練導致小鼠骨骼肌損傷，骨骼肌組織中MDA的含量明顯升高。朱洪竹等研究表明，遞增大強度運動造成大鼠骨骼肌損傷，與對照組相比運動組血清MDA的含量升高異常顯著。GSH是體內重要的抗氧化劑之一，在清除自由基及衍生物的毒性中起主要作用。Corbucci研究報導，馬拉松運動員跑完全程后股外肌GSH/GSSG比值由運動前16倍降低到運動后的3.26倍，證明肌肉中進行了大量的抗氧化過程。Antonello等報導，小鼠進行長時間力竭運動，肌肉中的GSH和GSSG的總量降到運動前水平的60以下。本研究中大鼠6周跑臺訓練后，組織勻漿中SOD活性、MDA含量、運動組顯著高于對照組，GSH濃度顯著低于對照組，與以往的研究具有一致性，說明實驗建模成功，即實驗設計的運動方案是可行的。

3.2過度訓練對大鼠骨骼肌Nrf2信號通路相關蛋白表達的影響

Nrf2信號通路是多細胞生物最為重要的內源性抗氧化應激通路。運動對Nrf2信號通路相關蛋白表達影響的研究較多，胡戈等研究顯示，長期大強度運動誘導大鼠心肌細胞凋亡中，大強度訓練組Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2的表達與對照組無顯著差異（P>0.05），但HO-1表達與對照組相比顯著下降（P<0.05）。郭新明等研究顯示，急性大強度運動導致大鼠機體產生氧化應激的同時，可明顯降低骨骼肌抗氧化通路關鍵蛋白Nrf2的相對表達量，也對抗氧化酶HO-1具有刺激作用。Grilly等研究表明，6周跑臺訓練后WT大鼠骨骼肌Nrf2轉錄活性提高。李鋒等研究顯示，長期大強度運動誘導的大鼠腎臟損傷中，大強度運動組腎臟細胞凋亡水平及Bax蛋白表達與對照組相比明顯增強（P<0.01），Bcl-2蛋白表達明顯減少（P<0.01），Nrf2蛋白表達變化沒有統計學差異（P>0.05），但HO-1蛋白表達減少（P<0.05）。Muthusamy等研究發現，急性運動導致WT大鼠心肌組織中Nrf2核積累和Nrf2-ARE結合活性顯著增加。上述研究結果不盡相同，主要是研究中采用的運動方式不同，以及運動的時間和強度大小不同。本研究中大鼠6周跑臺訓練后，與C組相比HT組肌組織中Nrf2表達水平降低，HO-1的表達量有顯著性差異，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平下降，促凋亡蛋白Bax表達水平升高，Keap1表達水平沒有變化，與已有長期大強度訓練導致Nrf2信號通路相關蛋白表達的研究結果具有較好的一致性。其原因可能是長期大強度訓練，引起大鼠機體氧化應激水平過高，出現了抗氧化抑制現象。

3.3刺梨補劑對過度訓練大鼠骨骼肌氧化應激損傷影響的分析

刺梨因富含VC、VE、VB族及微量元素、SOD、黃酮、多糖、多酚及多種人體必須氨基酸等營養素，大量的研究證實了刺梨在抗氧化應激方面具有較好的作用。夏星等研究表明，刺梨提取物能顯著增強小鼠的抗疲勞和耐缺氧能力，增加機體糖原儲備;陳慶等研究表明，刺梨多糖具有抗腫瘤和抗氧化活性的功能;楊江濤等研究表明，刺梨多糖可劑量依賴性地提高衰老小鼠體內抗氧化能力;張曉玲等研究表明，刺梨黃酮能有效保護胰臟免受四氧嘧啶氧化損傷，預防糖尿病;許夢捷等研究表明，刺梨多酚對小鼠黑色素瘤B16細胞增殖和酪氨酸酶活性均有一定的抑制作用。本研究中大鼠6周跑臺訓練后，與HT組相比，L-HT、H-HT組都表現出較好的抗氧化性，SOD活性、GSH濃度表達水平升高，MDA含量下降，且H-HT組比L-HT組在抗氧化方面表達效果更明顯，與已有的刺梨抗氧化應激研究具有一致性，再次驗證了刺梨的抗氧化應激損傷作用，同時還佐證了在一定范圍內，刺梨補劑量的多少與氧化應激效果呈負相關。

3.4刺梨補劑對過度訓練大鼠骨骼肌Nrf2信號通路、細胞凋亡相關蛋白表達的影響

黃酮、多酚等成分是刺梨的有機組成部分，以刺梨為研究對象，通過介導Nrf2信號通路發揮作用的研究較少，但以黃酮（蘆丁、槲皮素）、多酚類（茶多酚）物質研究Nrf2信號通路、細胞凋亡的研究較多。王斌等研究表明，蘆丁可上調Nrf2與HO-1蛋白表達水平，減輕梗阻性腎病大鼠腎臟氧化應激損傷;李陽等研究表明，低、高劑量槲皮素都能上調Nrf2以及下游抗氧化酶HO-1的蛋白含量和mRNA表達量，減輕T2DM大鼠胰腺氧化損傷，改善胰島素抵抗;馬濤等研究表明，茶多酚通過上調糖尿病腎病小鼠腎組織中Nrf2 、HO-1蛋白表達水平，減少氧化應激，保護腎臟;院慧芳等研究表明，刺梨黃酮通過下調Bax引起的心肌細胞凋亡作用，進而發揮心肌細胞的保護作用;陳輝等研究表明，刺梨黃酮通過下調CHF大鼠心肌組織中Integrinβ1和凋亡相關蛋白表達，對心臟具有保護作用。本研究中大鼠6周跑臺訓練后，與HT組相比，L-HT、H-HT組信號通路相關蛋白Nrf2、HO-1表達水平升高，有顯著性差異，且H-HT組比L-HT組在Nrf2、HO-1表達方面效果更明顯;細胞凋亡相關蛋白Bcl-2表達水平升高、Bax表達水平下降，Bcl-2/Bax比值增大，有顯著性差異，且H-HT組比L-HT組在Bcl-2/Bax值增加上更明顯，說明刺梨可激活Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、HO-1的表達，且在一定范圍內刺梨補劑量的多少與Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、HO-1的表達呈正相關，同時還證實了刺梨可降低細胞凋亡水平。

3.5刺梨介導Nrf2信號通路對過度訓練大鼠骨骼肌氧化應激損傷的保護機制

Nrf2信號通路是機體重要的內源性抗氧化應激通路，Nrf2是Nrf2信號通路中的一種關鍵蛋白，安靜狀態下Nrf2與Keap1結合，無活性，同時通過Keap1蛋白錨定在肌動蛋白細胞骨架上，使Nrf2持續泛化并被蛋白降解，保持細胞的酶類和抗氧化物處于基礎表達水平。Nrf2屬于CNC轉錄因子家族成員，具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結構，有6個功能區，分別為Neh1到Neh6，Neh1區中有一個亮氨酸拉鏈結構bzip，bzip與小Maf蛋白形成異二聚體，是Nrf2識別ARE上DNA基序的啟動子。Neh2區是Nrf2與Keap1結合區，N端包含了7個與泛素結合的賴氨酸殘基，對Nrf2的降解起負向調控作用。Neh3的C端是Nrf2轉錄必不可少的識別子，Neh4、Neh5位于Neh1和Neh2之間，是兩個獨立的激活區，與共激活因子CREB結合蛋白＼結合，對Nrf2目標基因轉錄活性激活。Keap1有NTR、BTB、IVR、DGR、CTR 5個結構域，其中DGR區含6個雙鏈甘氨酸重復片段，是Neh2、肌動蛋白結合的位點。BTB區與Keap1形成蛋白二聚體，與IVR具有聯動作用。IVR區富含半胱氨酸，能與酚羥基、自由基和ROS發生反應，引起自身構變，導致Keap1變構。抗氧化元件位于抗氧化酶等保護性基因5′端的啟動序列上，是特異的DNA啟動子結合序列，能夠啟動Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白的表達。

刺梨在基于Nrf2信號通路的抗氧化應激反應中具有級聯效應。其機理可能為，刺梨中的黃酮、多酚類分子多以酚羥基形式存在于刺梨中，酚羥基可以直接修飾IVR結構域中的半胱氨酸殘基，引起IVR發生變構，與BTB和Keap1形成的二聚體蛋白發生聯動作用，啟動DGR區的甘氨酸重復片段局部堿基的調整，引起DGR結構域變化，Neh2與Keap1親和力下降，Neh2與Keap1解離，進入核內，通過 Neh1上的bzip與小Maf蛋白形成的二聚體，在Neh3 C端的監視下，識別位于SOD、GSH-S-PX等保護性基因5′端的啟動序列（5-GAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATT-3）上的抗氧化元件，與CBP結合，對Nrf2目標基因轉錄活性激活，誘導HO-1表達增加。同時Nrf2還通過與Bcl-2基因啟動子反向鏈上的核苷酸-3 148和核苷酸-3 140之間的抗氧化反應元件結合，上調抗凋亡蛋白Bcl-2和下調促凋亡蛋白Bax的表達，減少細胞凋亡，緩解氧化應激損傷。

4結論

6周大強度跑臺訓練可加劇大鼠骨骼肌氧化應激反應和細胞凋亡，引起骨骼肌損傷;刺梨具有抗氧化應激反應和降低細胞凋亡水平等作用。運動期間的刺梨補充可通過介導Nrf2信號通路上調Nrf2和HO-1蛋白的表達，發揮抗氧化應激作用，同時刺梨補給量與Nrf2信號通路介導的抗氧化應激效應方面具有正相關性。

參考文獻：

[1]Poljsak B， uput D， Milisav I. Achieving the balance between ROS and antioxidants： when to use the synthetic antioxidants.Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2013（2013）：1-11.

[2]GiraldoI E， Lloret A， Fuhsberger T， et al. Aβ and tautoxicities in Alzheimer’s are linked via oxidative stress-induced p38activation：protective role of vitamin E. Redox Biology， 2014（2）：873-877.

[3]Reynolds D. Aldosterone-induced oxidative stress and inflammation in the brain are mediated by the endothelial cell mineralocorticoid receptor. Brain Research， 2016（1637）：146-153.

[4]付陽洋，劉佳敏，盧小鸞，等.刺梨主要活性成分及藥理作用研究進展.食品工業科技，2020，41（13）：328-335.

[5]曹晶晶，楊衛杰，曹軼.刺梨多糖的抗氧化和抗疲勞研究.中國中醫基礎醫學雜志，2018，24（4）：474-476.

[6]彭雋，任星峰.Nrf2信號通路在糖尿病腎臟疾病中的研究進展.臨床腎臟病雜志，2015，15（5）：315-318.

[7]何誠.實驗動物學.北京：中國農業大學出版社， 2013.

[8]Liu W， Feng S， Yang T， et al. Protective effects of curcumin against mercury-induced hepatic Injuries in rats， involvement of oxidative stress antagonism， and Nrf2-ARE pathway activation.Human & Experimental Toxicology，2017，36（9）：949-966.

[9]Powers Scott K， Radak Zsolt， Ji Li Li. Exercise-induced oxidative stress：past， present and future.The Journal of Physiology，2016，594（18）：5081-5092.

[10]查錫良，藥立波.生物化學與分子生物學.8版.北京：人民衛生出版社，2013.

[11]李鋒，曹卉，曹建民，等.蝦青素介導Nrf2信號通路對大強度運動誘導大鼠腎臟損傷的保護作用.山東體育學院學報，2020，36（2）：71-78.

[12]王建枝，殷蓮花.病理生理學.北京：人民衛生出版社，2013.

[13]康文錦，徐興軍，劉佳人，等.蒲公英多糖對小鼠體內抗氧化酶活性及相關基因表達的影響.動物營養學報，2020，32（12）：5910-5915.

[14]韓春華，王生，王元勛.膽紅素對急性運動所致骨骼肌線粒體氧化應激的保護作用.中國運動醫學雜志，2001，20（1）：27-28.

[15]高超，劉陽，趙佳，等. 姜黃素對急性游泳訓練小鼠骨骼肌損傷的保護作用.中國食物與營養， 2017，23（6）：54-58.

[16]朱洪竹，朱梅菊，蔡榮興，等.毛蕊花苷對大鼠遞增大強度運動下骨骼肌損傷的保護作用研究.山東體育學院學報，2019，35（1）：53-57.

[17]Corbucci G. The role of reduced glutathione during the course of acute haemolysis in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficient patients：clinical and pharmacodynamic aspects. International Journal of Clinical Pharmacology Research， 1990， 10（5）：305-310.

[18]Antonello Pietrangelo， Fabio Borella， Giovanna Casalgrandi. Antioxidant activity of silybin in vivo during long-term iron overload in rats. Gastroenterology，1995，109（6）.

[19]胡戈，曹建民，周海濤，等.蝦青素介導Nrf2信號通路減輕大強度運動誘導大鼠心肌細胞的凋亡.食品工業科技，2019，40（8）：266-271.

[20]郭新明，吳麗君，孫卓，等.補充蝦青素對人體急性大強度運動后代謝組學的影響.體育研究與教育，2019，34（2）：88-96.

[21]Grilly David M.， Gowans Gordon C.， McCann Don S.， et al. Effects of cocaine and d-amphetamine on sustained and selective attention in rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior， 1989， 33（4）：733-739.

[22]Bhakkiyalakshmi Elango，Sireesh Dornadula，Rajaguru Palanisamy，et al. The emerging role of redox-sensitive Nrf2-Keap1 pathway in diabetes.Pharmacological research：The official journal of The Italian Pharmacological Society，2015（9）：1104-114.

[23]夏星，鐘振國，廖林枝，等. 刺梨提取物影響小鼠抗疲勞及耐缺氧能力的研究.時珍國醫國藥，2012，23（7）：1664-1666.

[24]陳慶，李超，黃婷，等.刺梨多糖的理化性質、體外抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性.現代食品科技，2019，35（11）：114-119.

[25]楊江濤，楊娟，楊江冰，等. 刺梨多糖對衰老小鼠體內抗氧化能力的影響.營養學報，2008，30（4）：407-409.

[26]張曉玲，瞿偉菁，孫斌，等. 刺梨黃酮對實驗性糖尿病的預防作用. 營養學報，2004，26（6）：474-476.

[27]許夢捷，劉祖望，李禎鑫，等. 刺梨不同提取成分對B16細胞增殖及酪氨酸酶活性的影響.浙江中醫藥大學學報，2018，42（11）：883-889.

[28]王振偉，申森，胡曉冰. 刺梨中黃酮的超聲提取及HPLC測定.湖北農業科學，2014，53（19）：4684-4687.

[29]劉祖望，許夢捷，黃真，等. 大孔吸附樹脂純化刺梨多酚工藝的優化.中成藥，2019，41（1）：16-22.

[30]王斌，趙明，陳志勇，等.蘆丁對梗阻性腎病大鼠腎臟氧化應激損傷及Nrf2/HO-1通路的影響.重慶醫學，2019，48（2）：212-216.

[31]李陽，蘇艷瑜，李國豪，等.槲皮素通過Nrf2通路對糖尿病大鼠胰腺氧化損傷的拮抗作用機制.食品科學，2021，42（5）：208-214.

[32]馬濤，梁佳春，師軍華. 茶多酚調控Nrf-2/ARE信號通路對糖尿病腎病小鼠的影響.國際生物醫學工程雜志，2019，42（6）：469-473.

[33]院慧芳，張永春，蔡新華，等.刺梨黃酮對阿霉素所致心肌細胞毒性的保護作用.解剖學報，2019，50（1）：49-55.

[34]陳輝.刺梨黃酮對心衰大鼠Integrinβ1、FAK及BAX、Bcl-2、p53表達的影響.新鄉：新鄉醫學院，2019.

[35]Kang MI，Yamamoto M，Kim SG，et al. Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101（7）：2046-2051

[36]P Moi，K Chan，I Asunis，et al. Isolation of NF-E2-related factor 2 （Nrf2）， a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region..Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994，91（21）：9926-30.

[37]KItoh，N Wakabayashi，Y Katoh，et al. Keap1 represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain..Genes & development，1999，13（1）：76-86.

[38]Gao P.，Li L.，Ji L.，et al.Nrf2 ameliorates diabetic nephropathy progression by transcriptional repression of TGFβ1 through interactions with c-Jun and SP1.Biochimica et Biophysica Acta. Gene Regulatory Mechanisms，2014，1839（11）：1110-1120.

[39]Niture S.K.， Jaiswal A.K.. Nrf2 protein up-regulates antiapoptotic protein Bcl-2 and prevents cellular apoptosis.The Journal of Biological Chemistry，2012，287（13）：9873-9886.