通過生物信息學方法評估Treg細胞在泌尿系腫瘤中的浸潤模式

方啟翔，羅 楠，陳 煒，張 盼，吳大鵬，曾 津

(1.西安交通大學第一附屬醫院泌尿外科，陜西西安 710061；2．昆明醫科大學第二附屬醫院眼科，云南昆明 654100)

調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫應答無能和免疫抑制兩大特征的CD4+T細胞，可通過抑制效應性T細胞、肥大細胞、樹突狀細胞及B細胞的免疫反應下調機體對外來或自身抗原的應答水平以維持機體免疫耐受[1]。Treg對效應細胞的抑制作用具有兩面性，一方面對于維持宿主自我耐受很重要；另一方面在腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)中Treg對效應細胞的抑制被證明可抑制抗腫瘤免疫[2]。因此，在腫瘤的免疫治療中輔以針對Treg的治療方法或可達到增強療效的目的。現有研究證實，在乳腺癌、結直腸癌、肺癌和卵巢癌等腫瘤中Treg數量升高往往標志著預后不良[3]。有趣的是，也有研究發現Treg在腫瘤組織富集時可影響相關腫瘤進程，進而改善腫瘤患者預后[4]。目前認為這一矛盾可能由于腫瘤類型的差異、瘤內Treg細胞在表型和功能上存在異質性、Treg的分布模式(癌巢或基質)以及Treg與腫瘤中某些免疫亞群浸潤的模式[5]。

近年來隨著研究的深入,免疫治療在泌尿系腫瘤治療中的地位越來越高，Treg細胞與泌尿系腫瘤發生發展的關系也受到關注。現有研究多表明Treg細胞在腎癌、前列腺癌中的浸潤預示著不良預后，而在膀胱癌則尚存爭議。本文基于TCGA數據庫對Treg細胞在泌尿系腫瘤中的分布及預后進行評估，探討其在腫瘤預后、免疫治療中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料獲取我們從癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫下載了腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)腫瘤樣本539例和正常樣品72例、膀胱癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)腫瘤樣本411例和正常樣品19例、前列腺癌(prostate adenocarcinoma，PRAD)腫瘤樣本489例和正常樣品51例患者的轉錄組數據和臨床信息(表1)，本文下載的所有數據截止2020年11月15日。

1.2 免疫細胞矩陣的獲取在R語言中利用limma包進行標準化，提取腫瘤組織及正常組織mRNA表達譜數據，應用Perl語言整合CIBERSORT開源代碼(參見文獻[6]，運用反卷積算法開發，可基于標準化的基因表達數據來估算組織的細胞組成，量化細胞類型的豐度)來預測腫瘤及癌旁組織中免疫細胞的豐度，并對預測結果進行整理篩除，獲得樣本與免疫細胞的矩陣數據。并利用vioplot包對整理后的矩陣數據進行分析(P<0.05為差異具有統計學意義)，繪制3種腫瘤與癌旁組織內22種免疫細胞的小提琴圖。

1.3 Treg細胞與其他免疫細胞的相關性為了探討Treg細胞與其他免疫細胞的相關性，我們利用corrplot包對得到的腫瘤樣本免疫細胞矩陣進行相關性分析。

1.4 Treg細胞對腫瘤預后的影響利用Survival包完成Treg細胞豐度與患者預后的相關性計算并繪制生存曲線，而后對T分期與Treg細胞浸潤進行相關性分析。

1.5 Treg細胞與腫瘤中關鍵通路的相關性研究表明炎性環境與Treg細胞有關，而干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的水平可模擬炎性微環境[7]，因此我們進一步研究3種腫瘤中Treg浸潤程度是否與IFN-γ有關。我們通過ssGSEA自定義Hallmark(C2)基因集富集分析計算IFN-γ相關通路得分，并計算Treg與IFN-γ通路的相關性。另外，Treg細胞通過整合素αvβ8激活轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)，這一機制是Treg細胞抑制體內CD4+T細胞增殖的重要機制[8]。我們通過ssGSEA使用GO(BP)進行基因集富集分析獲得樣本整合素信號通路得分情況。

2 結 果

2.1 基線資料從TCGA數據庫網站下載腎透明細胞癌、膀胱癌、前列腺癌轉錄組及臨床資料(主要有性別、年齡、生存時間、生存狀態及TNM分期)，參見表1。

表1 TCGA中腎透明細胞癌、膀胱癌、前列腺癌患者的基線資料 [例(%)]

2.2 22種免疫細胞在腫瘤及癌旁組織中的分布與正常組織相比，腎透明細胞癌組織中的Treg細胞浸潤水平較高，差異有統計學意義(P=0.002，圖1A)。膀胱癌組織中的Treg細胞浸潤水平與正常組織相比無顯著差異(P=0.28，圖1B)，前列腺癌組織中Treg細胞的浸潤水平高于正常組織(P=0.011，圖1C)。

圖1 腎透明細胞癌(A)、膀胱癌(B)、前列腺癌(C)中Treg的浸潤水平

2.3 免疫細胞浸潤的相關性我們利用corrplot包對得到的腫瘤樣本免疫細胞矩陣進行相關性分析(P<0.05，圖2)。結果顯示：腎透明細胞癌組織中Treg與CD8+T細胞(r=0.25)、濾泡輔助性T細胞(r=0.25)呈弱的正相關，而與M2巨噬細胞(r=-0.30)、未活化肥大細胞(r=-0.23)、未活化CD4+記憶性T細胞(r=-0.28)呈弱的負相關。膀胱癌組織中Treg與幼稚B細胞(r=0.2)呈弱的正相關，而與活化CD4+記憶性T細胞(r=-0.27)呈弱的負相關。前列腺癌組織中Treg與CD8+T細胞(r=0.46)、記憶性B細胞(r=0.29)呈正相關，而與未活化肥大細胞(r=-0.29)、漿細胞(r=-0.24)呈弱的負相關。

圖2 腎透明細胞癌(A)、膀胱癌(B)、前列腺癌(C)中22種免疫細胞的相關性分析

2.4 Treg細胞對預后的影響及其與腫瘤T分期的相關性Treg在腎透明細胞癌中高密度浸潤與低生存率存在顯著相關性(P=0.01，圖3A)，Treg的浸潤與腫瘤組織大小相關(P=0.002，圖3D)，差異有統計學意義。而在膀胱癌中卻得到了相反的結果，Treg在膀胱癌中高密度浸潤與高生存率存在顯著相關性(P=0.045，圖3B)，但其浸潤密度與T分期無明顯相關性(P=0.905，圖3E)。Treg的浸潤程度似乎與前列腺癌患者的生存率和T分期無明顯相關性(圖3C、F)。

2.5 Treg細胞與腫瘤中的IFN-γ相關通路的相關性以及整合素信號通路得分我們研究了樣本中Treg的豐度分布、Treg細胞與IFN-γ相關通路的相關性以及各樣本中整合素信號通路激活的情況(圖4)。結果發現腎透明細胞癌、膀胱癌中Treg的豐度分布大致相同，前列腺癌樣品中Tregs豐度偏低。Treg與IFN-γ相關通路在腎透明細胞癌存在較弱正相關，膀胱癌、前列腺癌中存在著較弱負相關(|r|<0.2，P<0.05)，這一結果提示造成Treg在3種腫瘤中表現不一致可能與炎性微環境的差異有關。整合素信號通路得分情況在3種腫瘤中大致相似。

A：腎透明細胞癌；B：膀胱癌;C：前列腺癌。各圖左上：豐度；左下：與IFN-γ相關通路的相關性；右下：整合素信號通路表達。圖4 Treg細胞在腫瘤樣本中的豐度、Treg細胞與IFN-γ相關通路的相關性及腫瘤樣本中整合素信號通路表達

3 討 論

程序性死亡受體1(programmed death ligand-1，PD-1)是T細胞上的一種蛋白，可與腫瘤或正常細胞上的程序性死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1,PDL1)結合，導致T細胞功能下調，腫瘤可通過這一機制逃避免疫系統的清除[9-10]。免疫檢查點阻斷劑(immune checkpoint blockade,ICB)可通過阻止腫瘤細胞與T細胞間的相互作用，從而增強抗腫瘤免疫。但也帶來了新的問題，有文獻報道ICB對PD-1的阻斷可誘導Treg細胞增殖，從而導致抗腫瘤免疫的抑制，不僅降低了抗PD-1的作用，甚至引起腫瘤的超進展(hyperprogressive disease,HPD)[11]。因此，對于特定腫瘤消耗腫瘤微環境中的Treg細胞對于改善免疫治療的療效至關重要。

有研究表明Treg在腎癌中的浸潤不僅預示著不良結局，還與術后局部復發轉移相關[12]，前列腺癌患者接受的雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy，ADT)會造成Treg增加，降低ADT治療效果[13]。MALIN等[14]發現在體外Foxp3+Treg能夠抑制M2巨噬細胞以及基質金屬蛋白酶MMP2的產生，與膀胱癌良好預后相關。我們的研究發現Treg在腎透明細胞癌組織中高浸潤預示著不良預后，而在膀胱癌中高浸潤則代表了預后良好，這一結果與上述報道一致。既往研究表明Treg受到炎性環境調控，為了明確Treg在腎透明細胞癌和膀胱癌中出現相反的預后結局是否與炎性環境相關，我們進一步研究了腫瘤組織中IFN-γ與Treg的關系，結果顯示腎癌中IFN-γ與Treg正相關，而在膀胱癌中則是負相關。有研究表明炎性環境下DBC1基因可通過Caspase 8-p38信號通路介導Foxp3蛋白的減少及Treg功能的降低[15]，故我們認為Treg在腎透明細胞癌和膀胱癌中的不同預后表現可能是由于所處的炎性環境不同，這也可能是造成膀胱癌中Treg細胞浸潤水平與正常組織相比無顯著差異的原因。

現今，Treg在腫瘤中的作用仍然存在著爭議，這可能與炎性環境、Treg亞型、腫瘤分期有關，需要更多研究來揭示。我們基于TCGA評估了Treg在泌尿系腫瘤中的表現并對一些重要的通路進行了分析。我們的研究尚存在一些局限性，現有研究多使用腫瘤患者的外周血細胞及腫瘤組織得到Treg細胞的浸潤程度，我們采用算法估算可能存在一定誤差；我們從TCGA中獲得的樣本缺乏治療數據，不能排除不同治療方式引起的混雜。目前Treg在腫瘤中的作用機制正在日益清晰，并在聯合放療、化療、免疫治療中發揮重要作用[16]。深入挖掘其機制并將其作為腫瘤治療的一種手段是十分有意義的。

總之，利用生物信息學對Treg在腎透明細胞癌、膀胱癌、前列腺癌中的浸潤情況和對其預后的影響進行初步評估，提示Treg在腫瘤中的作用可能受到特定類型癌癥的影響，針對Treg的治療是一種有潛力的抗腫瘤方式。