對硝基苯乙二胺衍生化-HPLC檢測脂肽方法

時冠蘭

中國石油化工股份有限公司江蘇油田分公司石油工程技術研究院，江蘇揚州225001

生物表面活性劑是一類由微生物產生的代謝產物［1］，由一個或多個親水性和疏水性基團組成［2］，具有卓越的表/界面活性，同時還具有特殊的生物活性。生物表面活性劑的兩親結構使其能夠吸附于表/界面上，定向分散于水/油體系中，具有乳化［3］、滲透、潤濕［4］、分散、起泡、消泡和破乳等表/界面活性［5］。生物表面活性劑因其來源天然、生物親和［6］、易生物降解等特點，近年來受到廣泛的重視，被認為是最具潛力的表面活性劑之一［7-8］。

脂肽是生物表面活性劑中最受關注的一類，但其有來源復雜、產量低、提取周期長等缺點，這限制了對該生物表面活性劑的進一步研究，因此，建立便捷、快速且高效的定性定量分析方法是篩選產脂肽菌種的關鍵。目前高效液相色譜（HPLC）、油滴擴散、酸沉淀、表面張力和氨基酸顯色光度等方法已用于脂肽的定性和定量分析中，其中HPLC 是最靈敏的方法之一。HPLC 的紫外檢測是一種常見的脂肽檢測手段，大多脂肽含有酰胺鍵、酯鍵等結構，決定了其最大紫外吸收波長位于205 nm 左右，溶劑效應及絕大部分物質在此波長附近都有吸收，這導致直接HPLC法的檢測靈敏度及準確率下降［9］。針對以上問題，利用對硝基苯乙二胺衍生化-HPLC 法檢測脂肽，以改變Surfactin 的最大吸收波長并提高其紫外響應值，達到檢測低含量的脂肽以適用于Surfactin 的微量檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

LC-100 Plus 型高效液相色譜儀（HPLC），上海伍豐科學儀器有限公司；熒光檢測器，日本島津公司；LC-2000 型半制備色譜儀，Jasco CO-2060+Plus，日本分光公司。

1.2 脂肽樣品的制備

1）用半制備型HPLC 制備產物脂肽，制備條件如下：使用ODS 反相C18柱（10 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（0.1%甲酸）和水（0.1%甲酸）；梯度為0～90 min 乙腈保持90%，90～100 min乙腈從90%提高至100%；進樣量為1.00 mL 脂肽的乙腈溶液；紫外檢測器檢測波長為205 nm；流速為8.0 mL/min。根據色譜圖收集樣品中不同的組分并編號，將收集產物旋蒸后進行ESI 質譜分析，得到各編號離子的質荷比（m/z），對比分析后確定其成分。

2）分別將不同的產物溶液旋轉蒸發除去溶劑，再用乙腈溶解蒸餾燒瓶中的產物，將乙腈溶液倒入平板中，于通風櫥中吹干乙腈，刮取產物粉末得到純物質。

1.3 衍生試劑的選擇及吸收波長掃描

1）選擇可與Surfactin 肽鏈上的兩個羧基發生酯化反應或酰胺化反應并且有較強紫外吸收的試劑：對硝基苯甲醇、對硝基苯乙醇、對硝基苯乙胺、對硝基苯丙胺、對硝基苯乙二胺和對硝基苯肼。

2）用分析天平稱取上述衍生試劑各5.0 mg后分別置于7 mL EP 管中，分別加入3.0 mL 乙腈溶液并充分振蕩溶解，再于8 000 r/min離心3 min后分別取上清液于潔凈EP 管中并編號。用紫外分光光度計掃描衍生試劑在200～800 nm 波長的吸收情況，以乙腈作為空白對照。記錄衍生試劑最大吸收波長及該點處的吸光度（若吸光度過大，則用乙腈稀釋衍生試劑溶液并重復掃描直至最大吸收波長處吸光度小于0.8）。

1.4 Surfactin衍生效果檢測

1.4.1 酰胺化標記

稱取制備得到的Surfactin-C1560.3 mg，用乙腈定容至100.0 mL，得到質量濃度為0.603 g/L 的Surfactin-C15乙腈溶液。取該樣0.5 mL 和候選衍生試劑（對硝基苯乙胺、對硝基苯丙胺、對硝基苯乙二胺、對硝基苯肼），配制酰胺化體系如表1所示。

表1 Surfactin的酰胺化反應體系

將上述體系裝于100 mL 梨形燒瓶中，放入合適攪拌子后用玻璃塞封閉瓶口，于75 ℃油浴鍋中加熱攪拌反應3 h，待其冷卻后取出反應液至5 mL 比色管中，用1.0 mL 乙腈潤洗燒瓶3 次并將潤洗液合并于比色管中。用乙腈將反應液標定至5.0 mL，搖勻后取1.0 mL 樣品待檢測。另將本體系中的Surfactin 更換為20.0 mg 十六酸重復實驗作為對照。

1.4.2 酯化標記

取上述脂肽的乙腈溶液0.5 mL 于100 mL 梨形燒瓶中，旋蒸除去溶劑乙腈并加入候選衍生試劑（對硝基苯甲醇或對硝基苯乙醇），配制芳香烴環境酯化反應體系（見表2）、二氧六環環境酯化反應體系（見表3）及正己烷環境酯化反應體系（見表4）。

表2 Surfactin的芳香烴環境酯化反應體系

表3 Surfactin的二氧六環環境酯化反應體系

表4 Surfactin的正己烷環境酯化反應體系

按表2 將相關物質裝于100 mL 梨形燒瓶中，溶劑苯、甲苯、乙苯對應100、120 和140 ℃油浴鍋中分水回流反應3 h。待反應結束后保持原溫度，用分水器分離溶劑，靜置，待反應體系冷卻后向燒瓶中添加0.10 g 無水硫酸鈉中和硫酸并吸水。用1.0 mL 乙腈溶解反應產物，超聲振蕩3 min 后，將反應液移至5 mL 比色管中，用1.0 mL 乙腈潤洗燒瓶3 次并將潤洗液合并于比色管中，用乙腈將反應液標定至5.0 mL，搖勻后取1.0 mL 樣品用0.22 μm 微孔有機濾膜過濾后待檢測。另將體系中的Surfactin 更換為20.0 mg 十六酸重復實驗作對照。

按表3 將相關物質裝于100 mL 梨形燒瓶中，在120 ℃油浴鍋中分水回流反應3 h。后續處理步驟同表2 反應體系。另將體系中的Surfactin 更換為20.0 mg十六酸重復實驗作對照。

按表4 將相關物質裝于100 mL 梨形燒瓶中，80 ℃油浴鍋中分水回流反應3 h。后續處理步驟同表2 反應體系。另將體系中的Surfactin 更換為20.0 mg 十六酸重復實驗作對照，樣品過濾后檢測。

1.5 標記物鑒定

取純化樣品，旋蒸除去甲醇后用對硝基苯乙二胺標記，用0.22 μm 微孔有機濾膜過濾，之后進樣并進行液相色譜（LC）及液質聯用色譜（LCMS）檢測，同時取混合脂肽乙腈溶液直接進樣并進行LC 及LC-MS 作為對照。根據質荷比、反應后物質分子量確定脂肽標記的方式并確定LC 色譜圖中各個峰的組成。

LC 條件檢測波長設置為各衍生試劑對應的最大吸收波長。觀察是否有衍生化Surfactin-C15峰產生，并根據衍生化Surfactin-C15的峰面積篩選衍生試劑。

LC-MS 檢測使用超高壓反相柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），流動相為乙腈（0.1%甲酸）和水（0.1%甲酸），流速0.3 mL/min，梯度為0～10 min 乙腈從75%提高至99%，10～20 min乙腈保持在99%。流動相流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，質譜系統檢測器為ESI陽離子模式，Q-Exactive檢測器。

1.6 衍生化Surfactin標準曲線及檢出限

1.6.1 標準曲線

對硝基苯乙二胺標記不同濃度Surfactin-C15確定其標準曲線。取不同量的樣品，配制酰胺化標記體系（見表5），于100 mL 梨形燒瓶中密封攪拌并30 ℃油浴反應15 min。待反應體系冷卻后，吸取燒瓶中反應液置于10 mL比色管（含5 mL刻度），用0.5 mL乙腈洗滌燒瓶，溶解燒瓶壁殘留物質并將其吸取到比色管中，重復此操作直至將溶液定容至5 mL處，搖晃比色管使溶液均勻。吸取比色管中反應液，過濾后進樣HPLC檢測并統計雙標記Surfactin的峰面積及峰高，根據濃度制成標準曲線。

表5 對硝基苯乙二胺衍生化Surfactin-C15標準曲線試劑

另配制質量濃度分別為0.064、0.129、0.258、0.387、0.516 和0.645 g/L 的Surfactin-C15乙 腈 溶液，微孔濾膜過濾后用液相色譜檢測樣品205 nm波長吸收，其他條件參照上述酰胺化標記液相設置，統計雙標記Surfactin 的峰面積及峰高，根據濃度制成標準曲線。

1.6.2 檢出限

重復配制表5 中6 號樣品（不含Surfactin）并按照制作標準曲線的操作步驟重復實驗5 次，統計色譜圖中19.5～20.7 min 基線的噪音色譜信息，計算檢出限。

1.7 樣品測定的重復性及回收率

1.7.1 重復性

從同一搖瓶中取1.0 mL 發酵液，用硫酸將其pH調至2，過夜。用1.0 mL乙酸乙酯萃取脂肽，重復3 次，混合乙酸乙酯后在100 mL 燒瓶中旋干，添加標記體系后反應。待反應結束后旋轉蒸發除去反應溶劑，并添加1.0 mL 乙腈溶解樣品，過濾后進樣HPLC檢測。

1.7.2 回收率

從上述搖瓶中取1.0 mL 發酵液，加入0.250 mL Surfactin-C15的乙腈溶液（0.603 g/L），用硫酸將其pH 調至2，過夜。用1.0 mL 乙酸乙酯萃取脂肽3 次，混合乙酸乙酯后在100 mL 燒瓶中旋干，添加標記體系并反應，反應結束定容過濾檢測。

2 結果與討論

2.1 制備產物色譜圖及其ESI

HPLC 色譜圖有3 個明顯產物峰，標記為a、b、c，收集流動相，旋蒸得到相應產物，將產物用ESI 檢測確定成分，制備色譜圖和ESI 質譜圖，見圖1。由圖1可知：在陰離子模式下，a、b、c的質荷比分別為1 006.65、1 020.66、1 034.68，分別對應Surfactin-C13、Surfactin-C14、Surfactin-C15，其中Surfactin-C15含量最高，共分離得到Surfactin-C1325.6 mg、Surfactin-C1447.6 mg、Surfactin-C1560.3 mg。

圖1 制備產物色譜圖及其ESI質譜圖

2.2 標記試劑選擇

用紫外分光光度計掃描衍生試劑在溶劑乙腈中對各波段的吸收波長，各個衍生試劑的最大吸收波長見表6。

表6 衍生試劑在溶劑乙腈中最大吸收波長

由表6 可知：由于苯環上的硝基及對位的取代基團存在，各衍生試劑都出現了最大吸收波長移動現象，尤其是對硝基苯肼和對硝基苯乙二胺，苯環上對位的硝基和氨基產生共振現象，使其在乙腈中的最大吸收波長分別移至380 和386 nm，大大提高了屏蔽雜質的效果。

用各衍生試劑對應的最大吸收波長檢測對應的衍生產物，在對硝基苯肼、對硝基苯甲醇和對硝基苯乙醇對應的Surfactin 衍生產物色譜圖中未見明顯的色譜峰，但在其十六酸衍生產物的色譜圖中均有較明顯的色譜峰，這說明對硝基苯肼、對硝基苯甲醇和對硝基苯乙醇可與十六酸衍生物上的羧基發生酯化反應，但不易與Surfactin上的羧基發生反應。

在對硝基苯乙胺、對硝基苯丙胺及對硝基苯乙二胺對應的色譜圖中有較明顯的產物峰。相比于相同液相條件下未標記Surfactin 的峰，各Surfactin 衍生產物的保留時間有所延長，這可能是Surfactin 經衍生化后分子上的親水基團由羧基變成了硝基苯，親水性減弱，所以在C18反相柱中保留時間延長。作為對照的十六酸亦出現了明顯的色譜峰，其保留時間較Surfactin 更短，說明對硝基苯乙胺、對硝基苯丙胺及對硝基苯乙二胺可與Surfactin及脂肪酸反應。

對硝基苯乙胺、對硝基苯丙胺及對硝基苯乙二胺標記Surfactin 的衍生產物對應的色譜峰面積見表7。由表7 可知：酰胺化衍生體系Surfactin 的投料量相同且3 種衍生試劑的投料遠遠超過Surfactin（n（衍生試劑）∶n（Surfactin）≈1 000∶3），對硝基苯乙二胺標記的Surfactin色譜信號最強。

表7 不同標記物標記Surfactin-C15色譜峰面積

2.3 標記產物識別及分析

Surfactin 上有2 個羧基，為確定對硝基苯乙二胺和Surfactin 的反應程度，利用LC 及LC-MS對混合脂肽衍生產物進行識別，衍生前后液相色譜見圖2。由圖2可知：衍生后主要產物峰為對硝基苯乙二胺雙標記的Surfactin-C13（m/z=1 334.81）、Surfactin-C14（m/z =1 348.82）、Surfactin-C15（m/z =1 362.84）。衍生后的TIC 中也能發現Surfactin-C12、Surfactin-C16對應衍生化離子的存在，說明對硝基苯乙二胺的衍生率高，不易漏檢低含量的脂肽。但是質譜圖中沒有發現明顯的單標記Surfactin離子和未標記Surfactin離子，說明Surfactin上2個羧基都被充分反應了。通過質譜圖可確定對硝基苯乙二胺在70 ℃下反應180 min可完全反應。

圖2 Surfactin衍生前后液相色譜對比

對比Surfactin 衍生前的色譜峰發現，衍生Surfactin 峰面積更大，峰寬更窄且拖尾現象較弱。在峰面積方面，硝基是一種強生色團，氨基是一種強助色團，Surfactin 經對硝基苯乙二胺衍生后在相應的紫外波段有很強的吸收。Surfactin 在205 nm 波長處的吸收主要依賴于酰胺鍵及酯鍵上的碳氧雙鍵。在臨界濃度時，表面活性劑在溶液中的形態也有相應的改變，從單體締合成為膠束，Surfactin 的CMC 大致為1.0 × 10-5mol/L，因在液相的流動相中易形成較穩定的膠束，給柱分離造成一定的阻礙。經衍生試劑標記后，Surfactin的表面活性下降，CMC 增大或不形成膠束，峰寬降低且拖尾現象減少。

2.4 標準曲線及檢出限

對硝基苯乙二胺雙標記Surfactin 色譜信息見表8。Surfactin-C15衍生前后的峰面積標準曲線見圖3，其中y 為峰高，x 為進樣HPLC 樣品中Surfactin/衍生化Surfactin濃度。

表8 不同濃度Surfactin-C15色譜信息

由圖3 對比衍生前后Surfactin 曲線斜率可發現：在相同濃度的情況下，衍生后峰面積擴大約2.52 倍，峰高提高2.65 倍，這一點側面說明了衍生后的Surfactin 峰型有所改善，峰寬減少，峰高提高。利用標準曲線的斜率和色譜噪音及儀器信噪比確定了對硝基苯乙二胺衍生化Surfactin檢出限為6.75×10-2mg/L。

圖3 Surfactin-C15衍生前后色譜峰面積及峰高對應濃度標準曲線

2.5 重復性及回收率

重復衍生化并液相檢測等量相同濃度脂肽5次，平行樣相對標準偏差都在3%以內，表明衍生化方法具有良好的重復性。樣品回收率為99%～101%，說明對硝基苯乙二胺標記Surfactin 檢測的方法準確率高，適于Surfactin 的微量檢測。

3 結論

通過對硝基苯乙二胺標記的Surfactin 色譜信號最強，衍生率高，不易漏檢低含量的脂肽，能夠降低脂肽的檢出限。利用標準曲線的斜率和色譜噪音及儀器信噪比確定了對硝基苯乙二胺衍生化Surfactin 檢出限為6.75×10-2mg/L，相對標準偏差在3%以內，樣品回收率在99%～101%，表明該衍生化方法具有良好的重復性，檢測方法準確率高，適于Surfactin 的微量檢測。