‘正午’牡丹微繁殖技術體系的優化*

文書生 成仿云 鐘 原

(1. 北京林業大學園林學院 牡丹國際研究院 北京 100083； 2.南京林業大學風景園林學院 南京 210037)

牡丹(PaeoniaSect.Moutan)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)落葉灌木，是中國的傳統名花和重要的藥用植物(Cheng， 2007)，近年來，牡丹又被視為一種優質的木本油料資源(Lietal.， 2015)。然而，牡丹繁殖主要采用分株和嫁接的方法，繁殖效率低、周期長，難以實現優良品種的規模化生產。微繁殖技術可在短期內大量繁殖苗木，克服了傳統繁殖方法的缺陷，因此，建立牡丹微繁殖技術是其種苗規模化生產的必然趨勢。

牡丹微繁殖技術研究始于1984年(李玉龍等， 1984)，迄今已初步建立了20多個品種的微繁殖技術體系，但在一些關鍵環節仍存在問題： 1) 已研究報道了鱗芽(萌蘗芽、腋芽、花芽)和幼嫩莖段作為外植體的培養效果(孔祥生等， 1998； 李萍， 2007； 孟清秀等， 2011； 王蒙蒙等， 2018)，綜合比較發現鱗芽的污染率和誘導表現優于幼嫩莖段，但污染率(20%～60%)仍較高，無法滿足高效生產需求； 2) 已通過植物生長調節劑的篩選、培養基調節以及環境條件控制等方面的探索，成功構建了‘正午’、‘烏龍捧盛’、‘錦袍紅’牡丹等40多個品種的增殖培養體系，但增殖系數較低、試管苗質量較差(Wenetal.， 2020)，且目前廣泛使用的植物組織培養傳統光源——熒光燈，其光效低、能耗大、成本高； 3) 已通過生長素篩選、生根方式改良、培養環境調節等途徑，構建了牡丹試管苗兩步生根技術體系(Bouzaetal.，1994； Berutoetal.， 2007； 文書生等， 2016； Wenetal.， 2016a； 2016b； 王新等， 2016； Shangetal.， 2017； 王蒙蒙等， 2018)，組培苗生根率因品種而異(30%～100%)，且生根培養過程需更換培養基、流程復雜、成本高； 4) 移栽成活率低是制約牡丹微繁殖技術應用的又一瓶頸問題，這主要是由于生根試管苗質量差(生長勢弱、平均根數少)，且基部易產生大量愈傷組織，致使其移栽適應力較低(張穎星， 2008； 邱金梅， 2010； 王新等， 2016)。總之，目前牡丹微繁殖仍存在啟動培養污染嚴重，增殖效率低、能耗高，生根步驟復雜、生根苗質量差，移栽成活率低等突出問題(Wenetal.， 2020)，如何開展優化研究推進該技術的產業化應用是牡丹良種快繁的迫切需求。

‘正午’牡丹(P.×lemoinei‘High Noon’)是美國著名育種家Sunders于1952年育出的一個亞組間雜種(P.delavayi×P.suffruticosa)(Wister， 1995)，花黃色呈荷花型，一年可多次開花，適應性強，生產與應用前景廣闊(圖1A)。本課題組前期已建立了該品種的微繁殖技術體系(文書生等， 2016； Wenetal.， 2016a)，但與其他牡丹優良品種的微繁殖一樣，該技術產業化應用仍面臨上述一系列問題。鑒于此，本研究在已有工作基礎上(文書生等， 2016； Wenetal.， 2016a)，通過對不同外植體啟動培養效果的比較、增殖培養階段LED(light-emitting diodes，發光二極管)光源的應用以及生根方式的改進等，優化了‘正午’牡丹的微繁殖技術體系。研究結果不僅能夠為該品種的種苗規模化生產提供技術支撐，還可為其他牡丹優良品種微繁殖技術體系的建立提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 初代培養

供試材料為牡丹品種‘正午’，早春取萌蘗芽、腋芽和黃化嫩莖為外植體，取材母株健壯、無病蟲害。其中，萌蘗芽和腋芽取自鷲峰國家森林公園牡丹研究基地露地生長的母株，黃化嫩莖取自基地溫室盆栽的‘正午’牡丹經暗處理[2012年2—4月，(24±1)℃暗處理]后萌發的嫩莖。按照李萍(2007)構建的方法對材料進行表面滅菌，然后將鱗芽用滅菌的刀和鑷子剝除芽鱗、切除幼葉，并將黃化嫩莖切割成含1～2個葉腋的小莖段，再將處理后的外植體接種于初代培養基，培養基為WPM(CaCl2加倍)+BA 0.5 mg·L-1+GA30.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。

培養條件為溫度(25±1)℃，光照強度32.4 μmol·m-2s-1(熒光燈)，光照周期每天14 h(以下增殖和生根試驗若無特殊說明，培養條件與此相同)。培養50天后，統計不同外植體啟動培養的污染率、褐化率和存活率，并采用黃化嫩莖培養獲得的叢生芽開展后續試驗。每個處理接種30個外植體，3次重復。

1.2 增殖培養

繼代培養末期切取芽叢上莖長≥1.0 cm的健壯單芽作為試驗材料，切除其葉片后接種于增殖培養基，即WPM [3倍Ca(NO3)2·4H2O]+meta-topolin 5 μmol·L-1+GA31.5 μmol·L-1+檸檬酸 0.12 g·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。其中meta-topolin是一種新型細胞分裂素，本課題組前期研究發現其對‘正午’牡丹試管苗增殖的促進作用與BA相當，且后期生根率和移栽成活率更高(Wenetal.， 2016b)。試驗分2步： 1)光照強度為30 μmol·m-2s-1，設不同LED紅藍光質配比5組，以熒光燈為對照(表1)，篩選最佳LED紅光(R)和藍光(B)光質配比； 2)以試驗1)結果為基礎(70%R+30%B)，設不同LED光照強度處理(30，50，70，90 μmol·m-2s-1)，以篩選70%R+30%B LED光質配比條件下的最佳光照強度，從而建立增殖培養的最佳LED光照培養體系。增殖培養繼代周期為35天，培養末期統計不同處理的增殖系數(莖長≥1.0 cm芽數)、莖長、葉片數和鮮質量。試驗所用LED光源為飛利浦公司生產，紅藍燈珠交錯分布，光質均勻，采用LI-1500輻射照度測量儀和LI-190R光合有效輻射傳感器(美國LI-COR公司)測定組培架上方的光合有效輻射值，調至試驗所需光質和光照強度。每個處理接種18個單芽，重復3次。

表1 LED光處理的光質和光照強度①Tab.1 Qualities and intensities of LED light in treatments

1.3 生根培養

繼代培養末期切取芽叢上莖長≥1.0 cm的健壯單芽(保留全部葉片)進行復壯培養20天(圖1E)(文書生等， 2016)，再將單芽(保留1～2片葉)轉接至生根培養(圖1F)： 1)一步生根： 生根培養基為1/2 MS(CaCl2加倍)+IBA 1.0 mg·L-1+腐胺1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1(Wenetal.， 2016a)，pH5.8，培養基中附加不同濃度VB2(0、1、5、10、15 mg·L-1)，先置于黑暗條件下培養30天以誘導根原基，再轉入光照條件下培養20天促進根的伸長生長。2)兩步生根： 分為根誘導和根形成2個階段，即試管苗先于不含VB2的培養基中暗培養30天(培養基同上述一步生根)以誘導根原基，然后轉入根形成培養基1/2 MS(CaCl2加倍)+活性炭 4.0 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1(Wenetal.， 2016a)，pH6.2，光照培養20天。在上述一步、兩步生根法的根誘導階段(前30天)，皆先將試管苗置于4 ℃條件下暗培養8天，然后轉入(24±1)℃的條件下暗培養(Berutoetal.， 2007)。每個處理接種30株無根試管苗，重復3次。生根培養50天后，統計各處理的生根率、根數和根長，并評價試管苗基部的愈傷組織等級。

1.4 馴化移栽

將生根試管苗置于4 ℃冰箱中低溫暗處理30天解除休眠(Bouzaetal.，1992； 1994)； 然后，轉至室溫下瓶內煉苗1周； 分別取80株一步生根(1.0 mg·L-1VB2)與兩步生根的試管苗，根據生根質量、莖葉狀況以及基部愈傷組織大小將其分為3個質量等級(一級苗： 根數≥2條，莖葉發育良好，無莖尖壞死，基部愈傷組織極少； 二級苗： 根數1～2條，莖發育良好，葉發黃，基部膨大，有輕微愈傷組織； 三級苗： 根數1條，莖上部無葉，基部嚴重愈傷化，根從愈傷組織發出)，分別移栽到8 cm×8 cm×9 cm(長×寬×高)的塑料花盆，基質為經高壓滅菌(121 ℃，40 min)的珍珠巖︰蛭石︰草炭土(體積比1∶1∶1)。移栽苗置于人工氣候室管理： 溫度(20±1)℃，濕度70%，光照強度32.4 μmol·m-2s-1，光照周期每天14 h，移栽60天后，統計移栽成活率。第2年，將組培苗轉入溫室生長，進行正常的水肥管理。

1.5 數據處理

采用SPSS 18.0軟件對試驗數據進行One-Way ANOVA 分析并利用LSD法檢驗差異顯著性(P≤0.05)，其中生根率和移栽成活率采用反正弦轉換后再進行上述分析檢驗。

2 結果與分析

2.1 外植體類型對初代培養的影響

在啟動培養條件下，不同類型外植體的表現存在顯著差異(表2)。黃化嫩莖的污染率最低(19.59%)，萌蘗芽次之(32.79%)，腋芽最高(44.71%)。3種外植體褐化均較輕，其中黃化嫩莖幾乎不褐化。黃化嫩莖的存活率最高(80.41%)，萌蘗芽次之(64.75%)，腋芽最低(52.94%)。因此，與鱗芽外植體(萌蘗芽和腋芽)相比，黃化嫩莖在啟動培養中污染率更低、成活率更高，且不發生褐化(圖1B、C)。

表2 外植體類型對啟動培養的影響①Tab.2 Effects of explant types on initial culture

圖1 優化的‘正午’牡丹微繁殖技術Fig. 1 An optimized protocol for the micropropagation of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’A:‘正午’牡丹; B: 啟動培養10 d后萌動的鱗芽外植體; C: 啟動培養10 d后萌動的黃化嫩莖外植體; D: 試管苗于最佳LED光照培養條件下(光質配比70%紅光+30%藍光、光照強度50 μmol·m-2s-1)增殖培養3代獲得的叢生芽; E: 復壯培養20 d后的試管苗; F: 根誘導培養的試管苗; G: 一步生根法(IBA 1.0 mg·L-1，VB2 1.0 mg·L-1)獲得的生根苗; H: 移栽后于人工氣候室生長3個月的組培苗; I: 移栽后第2年于溫室正常生長的組培苗。A: Flowering plant of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’; B: Scale bud after 10 days of initial culture; C: Etiolated shoot after 10 days of initial culture; D: The shoot cluster after 3 subcultures under the optimal LED illumination(light quality 70% Red+30% Blue, light intensity 50 μmol·m-2s-1); E: Shoots obtained after 20 days of rejuvenation culture; F: Shoots in root induction culture; G: Rooted shoots obtained by one-step rooting method(IBA 1.0 mg·L-1, VB2 1.0 mg·L-1); H: Plantlets grown in artificial climate chamber after three months of ex vitro establishment; I: Plantlets grown in greenhouse after two year of ex vitro establishment.

2.2 LED光照培養體系的建立

2.2.1 紅藍光質配比篩選 適宜紅藍光質配比的LED光源可以顯著促進‘正午’牡丹試管苗的生長，但對增殖無顯著促進作用(圖2、圖3)。100%紅光(R)處理試管苗的增殖系數和莖長最大，且顯著高于熒光燈對照，但其莖葉白化、細長，生長不良； 100%藍光(B)處理試管苗莖葉深綠、生長正常，但增殖系數以及各項生長指標與熒光燈對照均無顯著差異； LED紅藍光質混合處理顯著提高了試管苗的莖長和葉片數，但其增殖系數和鮮質量與熒光燈對照無顯著差異，其中70% R+30% B處理試管苗的莖長(1.69 cm)和葉片數(8.74)均顯著高于對照，且整體生長健壯，因此該處理為‘正午’牡丹增殖培養的最佳LED紅藍光質配比。

圖2 LED光質配比對‘正午’牡丹試管苗增殖和生長的影響Fig. 2 Effects of LED light quality on in vitro shoot multiplication and growth of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’數據表示均值±標準差; 不同小寫字母表示在P ≤ 0.05水平差異顯著; W、R和B分別表示熒光燈、紅光和藍光。The data are means ± standard error; different letters indicate significant differences at P ≤ 0.05; W, R and B represent fluorescent lamp, LED light of red and blue, respectively.

圖3 不同紅藍光質配比條件下‘正午’牡丹試管苗的增殖和生長表現Fig. 3 In vitro shoot multiplication and growth of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’cultured under different light qualityA: W; B: 100%R; C: 80%R+20%B; D: 70%R+30%B; E: 60%R+40%B; F: 100%B. W、R和B分別表示熒光燈、紅光和藍光。W, R and B represent fluorescent lamp, LED light of red and blue, respectively.

2.2.2 光照強度篩選 在LED光質試驗篩選的最佳紅藍光質配比(70% R+30% B)條件下設置不同光照強度處理，結果顯示，光照強度對試管苗的增殖和生長均存在顯著影響(圖4、圖5)。增殖系數、葉片數均隨著光照強度的增大呈先上升后下降的趨勢，當光照強度為50 μmol·m-2s-1時，試管苗的增殖系數和葉片數均達到最大值，且顯著高于30 μmol·m-2s-1時； 適當提高光照強度有利于提高試管苗的鮮質量，50～90 μmol·m-2s-1光照強度處理的試管苗鮮質量顯著高于30 μmol·m-2s-1； 然而，提高光照強度對莖的伸長生長存在抑制，90 μmol·m-2s-1光照強度處理的試管苗莖長顯著低于30 μmol·m-2s-1。因此，在紅藍光質配比為70% R+30% B條件下，‘正午’牡丹增殖培養的最佳光照強度為50 μmol·m-2s-1，在該條件下試管苗繼續培養3代增殖和生長狀況良好(圖1D)。

圖4 光照強度對‘正午’牡丹試管苗增殖和生長的影響Fig. 4 Effects of illumination intensity on the in vitro shoot multiplication and growth of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’數據為均值±標準誤; 不同小寫字母表示在P≤0.05水平差異顯著。The data are means ± standard error; different letters indicate significant differences at P ≤ 0.05.

圖5 不同光照強度條件下‘正午’牡丹試管苗的增殖和生長表現Fig. 5 In vitro shoot multiplication and growth of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’cultured under different light intensityA: 30 μmol· m-2 s-1; B: 50 μmol· m-2 s-1; C: 70 μmol· m-2 s-1; D: 90 μmol· m-2 s-1.

2.3 一步生根體系的建立

通過VB2濃度篩選和生根光照條件控制，構建牡丹試管苗一步生根技術(表3)。結果顯示，在一步生根法中，不添加VB2處理的試管苗生根率最低(50.64%)，根數最少(1.09)，根長最短(1.21 cm)，且試管苗基部愈傷組織較多(等級2)。1.0～5.0 mg·L-1VB2處理的組培苗的生根率(71.07%～74.23%)和根數(3.17～3.34條)與兩步生根法(生根率77.21%，根數2.84條)無顯著差異，且試管苗基部愈傷組織極少(等級1)。但是，進一步提高VB2濃度至10～15 mg·L-1會抑制生根，15 mg·L-1VB2處理的試管苗的生根率、根數和根長皆顯著低于兩步生根法。因此，在生根培養基含1.0 mg·L-1IBA條件下，通過添加1～5 mg·L-1VB2以及培養過程中的光照條件控制(先暗培養30天，再光照培養20天)可以實現牡丹試管苗的一步生根，其生根效果與兩步生根法相當，且生根苗基部愈傷組織更少，有利于移栽成活(圖1G)。

表3 VB2對‘正午’牡丹試管苗生根的影響①Tab.3 Effects of VB2 on the in vitro rooting Paeonia× lemoinei ‘High Noon’

2.4 馴化移栽

分別調查一步和兩步生根處理試管苗移栽成活情況，發現試管苗質量與移栽成活率密切相關，一級苗成活率最高，移栽60天后成活率分別為85.00%(一步生根)和82.00%(兩步生根)，但二、三級苗移栽成活率較低，尤其是三級苗僅10%左右成活，且觀察發現莖基部高度膨大的愈傷組織易腐爛導致全株死亡(表4)。比較觀察2種生根方法獲得的生根苗質量，發現一步生根法獲得的生根苗基部愈傷組織較少，生根苗質量更佳，一級苗比例比兩步生根法提高了12.5%，且試管苗移栽后可以正常生長(表4； 圖1H、I)。

表4 生根方式對‘正午’牡丹試管苗移栽成活率的影響Tab.4 Effects of rooting method on transplanting survival rate of Paeonia× lemoinei ‘High Noon’plantlets

3 討論

3.1 黃化嫩莖是適宜的牡丹微繁殖外植體

牡丹微繁殖通常以休眠鱗芽為外植體，但最佳取材時間僅限于早春鱗芽萌動前，且滅菌污染率較高(Wenetal.， 2020)。本研究比較了黃化嫩莖與2種鱗芽(萌蘗芽、腋芽)的啟動培養效果，發現黃化嫩莖污染率較低(19.59%)，存活率較高(80.41%)，是一種優于鱗芽的外植體來源。然而，孔祥生等(1998)在牡丹‘洛陽紅’(P.suffruticosa‘Luoyang Hong’)中得出了完全相反的結論，發現鱗芽外植體滅菌成活率(63.5%～80.0%)顯著高于嫩莖(11.7%)。這可能與外植體預處理有關，前人研究采用的是大田植株早春萌發的嫩莖，本研究采用的黃化嫩莖在溫室暗處理(黃化)過程中降低了環境污染，且在滅菌環節能夠與滅菌劑充分接觸從而提高了滅菌效率，而黃化處理可降低外植體滅菌污染率在芍藥(P.lactiflora)中也有報道(王吉鳳等， 2012)。因此，外植體類型和預處理都是影響牡丹啟動培養的關鍵因素，與萌蘗芽和腋芽相比，黃化嫩莖更適宜用作牡丹微繁殖的外植體。綜合來看，采用黃化嫩莖進行離體培養打破了牡丹微繁殖只能在早春取鱗芽外植體的限制，其滅菌染菌率低于鱗芽，在工廠化生產方面具備更高的可行性和生產效率。

3.2 LED光照培養可促進牡丹試管苗的增殖和生長

光是影響植物生長發育最重要的環境因子之一，光質和光照強度對植物的生長發育、形態建成和生理代謝等均有重要調控作用(高榮孚等， 2002)。紅光和藍光是植物生長必需的2種光譜，也是光合色素吸收的主要光譜(Macedoetal.， 2011； 馬宏等， 2017)。本研究發現單一紅光(R)或藍光(B)無法滿足‘正午’牡丹試管苗的增殖培養需求，其中紅光有利于試管苗的腋芽萌發和莖的伸長，但100% R處理的試管苗莖葉白化、細長，生長不良，這與在非洲菊(Gerberajamesonii)(孫翊等， 2017)、菊花(Chrysanthemummorifolium)(Diercketal.， 2017)等植物中的研究結論一致； 100% B處理試管苗的莖葉深綠、生長正常，但增殖系數和各項生長指標與熒光燈對照均無顯著差異，這可能是由于藍光促進了葉綠素合成的原因(孫翊等， 2017； 項蕾蕾等， 2020)。進一步嘗試不同光質配比發現，適宜配比的紅藍復合光(70% R+30% B)能夠疊加紅藍單色光的優點，可以顯著促進‘正午’牡丹試管苗的生長(葉片數、莖長)，但對增殖無顯著促進作用。然而，這與牡丹品種‘烏龍捧盛’(P.suffruticosa‘Wulong Pengsheng’)(75% R+25% B)、‘洛陽紅’(75% R+25% B)以及‘胡紅’(P.suffruticosa‘Hu Hong’)(50% R+50% B)(岳嵐， 2008)試管苗的最佳光質配比不一致，說明不同牡丹品種對紅藍光的需求量存在一定差異，LED光源在牡丹微繁殖中的應用需根據品種篩選最佳的紅藍光質配比。此外，光照強度也是影響植物生長發育的重要光照參數，光照強度過強過弱都會抑制光合作用，從而限制植物生長(尚三娟等， 2020)。目前，牡丹增殖培養的常用光照強度為30 μmol·m-2s-1，本研究發現在LED光質配比70%R+30%B條件下，適當提高光照強度可以顯著促進試管苗的增殖和生長，其中50 μmol·m-2s-1為最佳處理，其增殖系數(3.79)、葉片數(15.75)和鮮質量(410.21 mg)均顯著高于30 μmol·m-2s-1處理的相關指標，這與牡丹‘烏龍捧盛’試管苗的最佳光照強度(閆新房， 2009)一致。

綜上所述，與傳統熒光燈光源(30 μmol·m-2s-1)相比，適宜的LED光源(光質配比70%R+30%B，光照強度50 μmol·m-2s-1)可以顯著促進‘正午’牡丹試管苗的增殖和生長，將增殖系數由2.15提高到3.79，且試管苗生長健壯，從而優化了微繁殖技術的增殖培養環節。然而，目前LED光源在牡丹微繁殖中的應用仍處于技術探索階段，對于光質和光照強度調控牡丹試管苗增殖和生長的內在機理還有待進一步探索。

3.3 一步直接生根法是牡丹試管苗生根的有效技術

IBA是有效誘導牡丹不定根發生的常用生長素，前人比較了不同生根方式(一步生根法、兩步生根法)的生根效果，發現兩步生根法生根率較高，即先將試管苗置于含IBA的培養基暗培養以誘導根原基，再轉至不含生長素的培養基培養以促進不定根伸長(Bouzaetal.， 1994； Berutoetal.， 2007)。兩步生根法成功的主要原因在于根原基誘導需要生長素刺激，而后續不定根伸長不需要高濃度生長素(王清民等， 2006； 賀丹等， 2011； 尚文倩等， 2021)，此時若繼續給予高濃度生長素反而會對不定根伸長產生一定的抑制作用，因此兩步生根法被廣泛應用于核桃(Juglansregia)(裴東等， 2002； 樊靖等， 2009)、柿樹(Diospyroskaki)(劉一鳳， 2017)以及梨(Pyruscommunis)(苗冉冉等， 2019)等難生根的木本植物中。目前，兩步生根法是牡丹試管苗生根的主要方式(文書生等， 2016； Wenetal.， 2016a； 2016b； 王新等， 2016； Shangetal.， 2017； 王蒙蒙等， 2018)，但培養過程需更換培養基，流程復雜、成本高，并不利于生產推廣。

有研究發現，IBA和VB2在黑暗條件下性質基本穩定，但在光照條件下均會逐漸分解； 培養基中二者共存時，VB2在光照下的分解速度不受IBA的影響，而IBA在光照下的分解速度卻因VB2的存在而加快(Fossardetal.， 1974； Drewetal.， 1991； 1993)。據此本研究構建了新型牡丹試管苗一步生根技術，即試管苗先于附加IBA 1.0 mg·L-1和VB21.0～5.0 mg·L-1的培養基中暗培養誘導根原基30天，再轉至光照下培養20天利用VB2加速分解IBA以促進不定根伸長。該方法所得生根率(71.07%～74.23%)和根數(3.17～3.34條)與兩步生根法(生根率77.21%，根數2.84條)無顯著差異，這與番木瓜(Caricapapaya)(Drewetal.， 1991)中的研究結果一致，說明利用IBA和VB2的光反應特性可以實現牡丹試管苗高效一步生根，這可能是由于VB2可以充當生長素光氧化反應的光受體，繼而促進生長素的分解，從而避免了生長素對不定根伸長生長的抑制作用(Galstonetal.， 1949a； 1949b； Gorstetal.， 1983)。此外，本研究中一步生根法(VB21.0～5.0 mg·L-1)獲得的生根苗基部愈傷組織較少，更易于移栽成活，這主要是由于試管苗基部愈傷組織易造成根與莖的維管組織連接不暢(賀丹等， 2011； 賈文慶等， 2013)，且移栽后愈傷組織極易腐爛導致植株死亡(張穎星， 2008； 邱金梅， 2010； 王新等， 2016)。本研究建立的一步生根法與前人報道的牡丹一步生根法(Bouzaetal.， 1994； Berutoetal.， 2007)相比，其通過VB2的使用以及培養過程的光照條件控制大幅提高了生根率和生根質量； 與牡丹兩步生根法(文書生等， 2016； Wenetal.， 2016a； 2016b； 王新等， 2016； Shangetal.， 2017； 王蒙蒙等， 2018)相比，其操作流程簡單、生產成本低、移栽成活率高，可以在牡丹微繁殖中推廣應用。然而，鑒于不同牡丹品種不定根誘導適宜的IBA濃度存在較大差異，其對應VB2處理濃度也需進行相應調整，本研究報道的IBA和VB2濃度僅供參考。

4 結論

本研究圍繞牡丹微繁殖過程中啟動、增殖、生根、移栽階段存在的突出問題，對‘正午’牡丹微繁殖技術進行了優化： 發掘了優于鱗芽的外植體類型——黃化嫩莖，能夠有效降低污染、提高啟動培養的成活率； 建立了LED光照培養體系(光質配比70%紅光+30%藍光，光照強度50 μmol·m-2s-1)，該光照條件顯著促進了試管苗的增殖和生長； 通過在生根培養基中添加1.0 mg·L-1IBA和1～5 mg·L-1VB2，結合培養過程光照條件控制(暗培養30天后再光照培養20天)，建立了高效的牡丹試管苗一步生根法，在不降低生根率的前提下，提高了生根苗質量與移栽成活率。本研究所建立和優化的‘正午’牡丹微繁殖技術體系，不僅能夠促進該品種種苗規模化生產，還可以為其他牡丹品種的微繁殖研究提供參考和借鑒。