四川山胡椒葉綠體基因組特征及山胡椒屬系統發育*

劉 潮 唐利洲 韓利紅

(曲靖師范學院生物資源與食品工程學院 云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態適應性進化重點實驗室 云南省高校特色果酒技術創新與應用工程研究中心 曲靖 655011)

四川山胡椒(Linderasetchuenensis)為樟科(Lauraceae)山胡椒屬(Lindera)常綠灌木，多生于山坡路旁及疏林中，分布于我國四川、貴州等地(http:∥www.iplant.cn/frps)。四川山胡椒葉片提取物香精油對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和大腸桿菌(Escherichiacoli)均具有明顯的抑制作用(Weietal.， 2016)，其葉片中提取的多種化合物具有抗腫瘤活性(袁娟娟， 2018； 張嘉穗， 2016)。

葉綠體是質體的一種，為綠色植物光合作用的場所，具有相對獨立的遺傳系統。陸生植物葉綠體基因組大小范圍為107～218 kb，具有高度保守的四分體結構，包括2個反向重復區(inverted repeats，IR)，以及被IR分隔的大單拷貝區(large single copy，LSC)和小單拷貝區(small single copy，SSC)(Danielletal.， 2016)。葉綠體基因組編碼120～130個基因，主要參與光合作用、基因轉錄和翻譯(Danielletal.， 2016)。目前多個山胡椒屬物種葉綠體基因組已被相繼報道(Songetal.， 2020； Zhaoetal.， 2018； Tianetal.， 2019)。完整的葉綠體基因組序列對于了解植物相近類群之間的系統發育關系和物種進化具有重要價值(Danielletal.， 2016)，基于高通量測序的系統進化基因組學研究，成為全面理解生物進化的重要工具(Songetal.， 2020)。葉綠體基因組數據已經很好地解決了樟科等多種植物類群的系統發育關系(Songetal.， 2017； 2020； Zhaoetal.， 2020； Xieetal.， 2020)。密碼子使用偏性可以反映葉綠體基因組進化特征及其影響因素，在基因表達中起重要作用(Boeletal.， 2016)。葉綠體基因組條形碼可用于品種鑒定和種質資源保護，物種特有的重復序列可以作為一種潛在的遺傳多樣性標記。葉綠體基因組結構特征和進化研究，對于分析物種遺傳背景和系統發育關系都具有重要的意義。

四川山胡椒具有重要的潛在藥用價值，然而關于四川山胡椒物種遺傳多樣性、進化和發育方面的研究較少，未見葉綠體基因組方面的報道。本研究首次通過高通量測序技術獲得四川山胡椒葉綠體基因組序列，并對葉綠體基因組序列重復、密碼子使用偏性，山胡椒屬物種葉綠體基因組高變區和進化發育關系進行分析，以期為四川山胡椒的遺傳背景、進化發育和種質資源保護提供借鑒。

1材料與方法

1.1 試驗材料 四川山胡椒采自江蘇省南京中山植物園(118°50′3.19″E，32°03′9.67″N)，新鮮葉片置于硅膠中保存。標本存放于中國科學院西雙版納熱帶植物園(標本號XTBG-BRG-SY36159)。用改良的CTAB法從葉組織中提取四川山胡椒總DNA(Doyleetal.， 1987)，構建測序文庫。基于Illumina Genome Analyzer Hiseq 2000測序平臺進行葉綠體基因組測序。

1.2 四川山胡椒葉綠體基因組組裝與注釋 使用GetOrganelle軟件(Jinetal.， 2020)組裝獲得完整葉綠體基因組。四川山胡椒完整葉綠體基因組數據上傳LCGDB 數據庫(http:∥lcgdb.wordpress.com)，訪問號LAU00108。以山胡椒(Linderaglauca)葉綠體基因組(登錄號MG581443)為參考，利用GeSeq(https:∥chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html)進行基因組注釋。利用OGDRAW軟件(https:∥chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制葉綠體基因組圖譜(Greineretal.， 2019)。

1.3 四川山胡椒葉綠體密碼子使用偏性分析 利用CodonW 1.4.2軟件分析四川山胡椒葉綠體基因組編碼基因的有效密碼子數(effective number of codon，ENC)以及鳥嘌呤(guanine)和胞嘧啶(cytosine)含量(GC)，通過EMBOSS在線網站(http:∥emboss.toulouse.inra.fr/)的cusp軟件分析相對同義密碼子使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)。分別選取ENC值較小和較大的10%基因作為高表達基因(high expression gene，HEG)和低表達基因(low expression gene，LEG)，計算ΔRSCU值(ΔRSCU=RSCU高表達-RSCU低表達)。密碼子RSCU>1則為高頻密碼子，同時滿足ΔRSCU≥0.08則為最優密碼子。

1.4 四川山胡椒葉綠體序列重復分析 通過REPuter軟件(Kurtzetal.， 2001)分析序列重復，最小重復長度為30 bp，序列同源性90%，Hamming距離3，分析了互補(complementary)、正向(forward)、反向(reverse)和回文(palindromic)重復。利用MISA在線工具檢測SSR(Beieretal.， 2017)，分析的最小閾值為單核苷酸重復次數8，二核苷酸重復次數4，三核苷酸重復次數4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復次數均為3。

1.5 山胡椒屬核苷酸多樣性分析 通過MAFFT v. 7.450(Katohetal.， 2019)對山胡椒屬物種葉綠體基因組序列進行多序列比對，利用DnaSP 6.0計算核苷酸多態性值(Rozasetal.， 2017)，設置搜索窗口長度為600 bp，步長為200 bp，使用R程序繪圖。

1.6 山胡椒屬系統發育分析 從NCBI和LCGDB數據庫下載30種山胡椒屬和樟屬(Cinnamomum)物種的葉綠體基因組序列，其中三椏烏藥(Linderaobtusiloba，LAU00057)序列由LCGDB數據庫下載，其他物種序列由NCBI的GenBank數據庫下載。利用四川山胡椒和28個山胡椒屬物種的葉綠體基因組序列，以樟(Cinnamomumcamphora)和沉水樟(C.micranthum)為外類群，使用MAFFT v. 7.450進行多序列比對，通過IQ-TREE v. 2.1.1軟件(Minhetal.， 2020)基于最大似然法(maximum likelihood，ML)構建系統進化樹，建樹模型為K3Pu+F+R3，步長值為1 000。

2 結果與分析

2.1 葉綠體基因組結構特征 四川山胡椒葉綠體基因組全長為152 851 bp(圖1)，與其他山胡椒屬物種大小相當(Tianetal.， 2019； Songetal.， 2020； Zhaoetal.， 2018)，呈典型的四分結構，LSC、SSC和IR區大小分別為93 742 bp、18 977 bp和20 066 bp。基因組總GC含量為39.15%，IR區GC含量最高(44.42%)，其次為LSC(37.94%)，SSC最低(33.95%)。四川山胡椒葉綠體基因組共編碼125個基因，其中蛋白編碼基因81個，轉運RNA(tRNA)36個，核糖體RNA(rRNA)8個，13個基因為雙拷貝基因。

圖1 四川山胡椒葉綠體基因組結構Fig. 1 Complete chloroplast genome map of Lindera setchuenensis

2.2 葉綠體蛋白編碼基因密碼子偏性分析 四川山胡椒葉綠體蛋白編碼基因GC含量為39.13%，鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的出現頻率GC3s為27.96%，平均ENC值為49.11。蛋白編碼基因高頻密碼子有31個(表1)，其中13個以A結尾，16個以U(T)結尾，以G和C結尾的分別有1個。最優密碼子有21個，其中9個以A結尾，11個以U(T)結尾，1個以G結尾。

表1 四川山胡椒葉綠體基因組相對同義密碼子使用度①Tab.1 Relative synonymous codon usage of genes in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

2.3 葉綠體基因組序列重復分析 四川山胡椒葉綠體基因組中共檢測到27對長序列重復(圖2)，長度30 bp的序列數目最多，位于IR、LSC和SSC上的數目分別為8、13和3，其次為33 bp的序列，分別有14和2個位于IR和LSC上。長序列重復中，正向重復最多，達24個(占44%)，其次為回文重復22個(占41%)，反向重復和互補重復分別為6個和2個，其中33 bp和30 bp的序列在正向重復和回文重復中均占較高比例，30 bp重復多數位于LSC和IR上，33 bp重復多數位于IR上。

圖2 四川山胡椒葉綠體基因組序列重復Fig. 2 Repeats in the chloroplast genome of Lindera setchuenensisLSC、SSC和IR分別表示大單拷貝區、小單拷貝區和反向重復區，其后數值表示序列重復長度。LSC, SSC and IR represent large single copy, small single copy and inverted repeats, respectively, and the subsequent values represent the sequence repeat length.

四川山胡椒葉綠體基因組中發現13種類型共181個SSR位點(圖3)。其中，單堿基SSR數目最多，占SSR總數的71.27%，其次為雙堿基SSR，占20.44%。A/T類SSR占單堿基SSR的95.35%，AT/AT類堿基占雙堿基SSR的51.35%(圖3)。55%的SSR位于基因間區，29%位于編碼序列(coding sequence，CDS)上，15%位于內含子區，僅有1%位于rRNA上(圖4)。

圖3 四川山胡椒葉綠體基因組SSR位點類型及數量Fig. 3 The types and number of SSRs in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

圖4 四川山胡椒葉綠體基因組SSR 位點分布Fig. 4 The distribution of SSRs in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

2.4 山胡椒屬序列突變熱點分析 序列突變熱點(mutational hotspots)又稱高變區(hyper-variable regions)，可為設計準確、穩定而高效的分子標記和物種條形碼提供參考(Niuetal.， 2021)。使用DnaSP 6.0軟件分析了山胡椒屬核苷酸多態性位點(圖5)，序列比對總長度為156 450 bp，序列一致位點長度為150 149 bp，突變位點數為4 351，大約2.78%為多態性位點，核苷酸多樣性值范圍為0～0.019 79，平均值為0.004 08。鑒定的6個高變區中，3個位于LSC區(petA-psbJ、trnH-psbA、petK-psbI)，3個位于SSC區(ycf1、ccsA-ndhD、rpl32-trnL)，IR區沒有高變區，表明單拷貝區核苷酸多態性明顯高于IR區。

圖5 山胡椒屬葉綠體基因組序列核苷酸多態性分析Fig. 5 The nucleotide diversity(Pi) of chloroplast genome sequence of the genus Lindera

2.5 山胡椒屬系統發育分析 利用IQtree軟件使用最適模型K3Pu+F+R3構建的ML進化樹，展示了山胡椒屬物種的系統發育關系(圖6)。山胡椒屬物種歸為5個聚類組： 聚類組1成員最多，為11個，其次是聚類組4，有8個成員，聚類組2和聚類組5分別有5個和4個成員，聚類組3僅有三椏烏藥1種。四川山胡椒與黑殼楠(Linderamegaphylla)、紅脈釣樟(L.rubronervia)、大果山胡椒(L.praecox)、綠葉甘橿(L.neesiana)、絨毛釣樟(L.floribunda)、山橿(L.reflexa)歸在聚類組4，與黑殼楠親緣關系最近。

圖6 基于最大似然法構建的山胡椒屬葉綠體基因組系統發育樹Fig. 6 The Maximum-likelihood tree of Lindera species based on analyses of the chloroplast genomes

3 討論

植物葉綠體基因組為了解葉綠體功能、細胞內基因轉移、物種多樣性、植物資源保護和遺傳育種提供分子基礎(Danielletal.， 2016)。本研究對四川山胡椒葉綠體基因組進行測序、組裝和注釋，獲得了完整的葉綠體基因組數據。四川山胡椒葉綠體基因組大小為152 851 bp，具有典型的四分體結構，與之前公布的山胡椒屬物種一致(Zhaoetal.， 2018)。本研究以山胡椒葉綠體基因組(MG581443)為參考，對四川山胡椒葉綠體基因組進行注釋，發現四川山胡椒基因組共編碼125個基因，其中單拷貝基因112個，該結果與Zhao等(2018)和Tian等(2019)的注釋略有不同，這與基因組注釋時的參考基因組不同有關。

密碼子使用偏性是物種對環境的長期適應性進化的結果，受多種因素的共同影響(Duanetal.， 2021)。RSCU值反映了不同基因的密碼子使用模式，數值越高表示該密碼子使用頻率越高(Sharpetal.， 1987)。四川山胡椒葉綠體基因組總GC含量為39.15%，IR區GC含量明顯高于單拷貝區，蛋白編碼基因GC含量與葉綠體基因組接近，而GC3s明顯較低(27.96%)，這與山胡椒屬其他物種類似(Zhaoetal.， 2018； Tianetal.， 2019； Xiaoetal.， 2020)。31個高頻密碼子中以A/U(T)結尾的占94%，21個最優密碼子中以A/U(T)結尾的占95%，這與其他植物葉綠體基因組密碼子使用偏性(Duanetal.， 2021)一致，表明葉綠體基因密碼子第3位堿基存在不對稱性，并表現出對A/U(T)的偏好性(Duanetal.， 2021； 鄭祎等， 2020； 周曉君等， 2020)。

序列重復廣泛存在于植物葉綠體基因組中，在基因表達和調控中起著重要作用，由于這些區域存在高度序列多態性，對于研究分子進化和遺傳多樣性以及開發植物育種所必需的分子標記具有重要意義(蔣明等， 2020； Zhengetal.， 2020； Zhuetal.， 2021)。四川山胡椒葉綠體基因組長序列重復中，正向重復和回文重復含量較高，30 bp序列重復主要分布在單拷貝區，33 bp序列重復主要分布在IR區。基因組SSR位點含有較高比例的A/T，其中單堿基SSR以A/T型為主，55%的SSR位于基因間區，與Tian等(2019)結果類似，SSR較高的A/T含量可能與葉綠體基因組A/T含量較高有關。豐富的回文序列可能為基因組提供一些二級結構，而單核苷酸重復序列可能比其他SSR提供了更多的系統發育信號。基因組中6個高變區均位于單拷貝區，其中3個位于LSC，3個位于SSC，高變區trnH-psbA、psbK-psbI、petA-psbJ、ccsA-ndhD、ycf1與Zhao等(2018)和Tian等(2019)研究結果一致，可作為山胡椒屬DNA條形碼用于物種鑒定。所篩選的多態性SSR和高變區可為山胡椒屬物種的鑒定和分子標記輔助育種提供參考。

山胡椒屬具有重要的經濟和藥用價值。多個山胡椒屬物種葉綠體基因組的公布，為山胡椒屬系統發育研究提供了強有力的數據支撐。為了解四川山胡椒與山胡椒屬其他物種之間的系統發育關系，本研究基于已公布的葉綠體基因組數據構建了山胡椒屬物種的系統發育樹。Zhao等(2018)將山胡椒屬分為2個或4個支系，本研究基于進化樹支持率將山胡椒屬分為5個聚類組，四川山胡椒分在聚類組4，與黑殼楠親緣關系最近，該結果與Tian等(2019)研究結果一致。根據崔鴻賓(1987)基于生物學性狀的分類，山胡椒屬分為5個組(Section)，本研究中聚類組1、聚類組2和聚類組3均屬于單系組，其中聚類組1物種屬于三出脈組(LinderaSectionDaphnidium)(除美國山胡椒未記錄外)，聚類組2屬于長梗組(LinderaSectionAperula)，聚類組3僅有三椏烏藥一種，屬于掌脈組(LinderaSectionPalminerviae)； 聚類組4為多系組，屬于山胡椒組(LinderaSectionLindera)、三出脈組、球果組(LinderaSectionSphaerocarpae)和杯托組(LinderaSectionCupuliformes)，聚類組5屬于山胡椒組和多蕊組(LinderaSectionPolyadenia)。分析表明，僅基于是否落葉、葉片或頂芽等生物學特征進行的山胡椒屬物種分類具有一定局限性，基于葉綠體基因組的系統發育分析對于明確山胡椒屬物種的系統演化具有重要的參考價值。

4 結論

本研究基于高通量測序技術，從頭測序并組裝了完整的四川山胡椒葉綠體基因組。該基因組呈典型的四分體結構，基因組全長為152 851 bp，LSC、SSC和IR區大小分別為93 742、18 977、20 066 bp。27對長序列重復中，正向重復最多，其中33 bp和30 bp的序列在正向重復和回文重復均占較高比例。181個SSR位點中，單堿基SSR數目最多，多數SSR位于基因間區。四川山胡椒葉綠體基因組共編碼125個基因，偏好以A或U(T)結尾的密碼子。6個高變區中，3個位于LSC區(petA-psbJ、trnH-psbA、petK-psbI)，3個位于SSC區(ycf1、ccsA-ndhD、rpl32-trnL)。系統發育關系上，山胡椒屬物種歸為5個聚類組，四川山胡椒與黑殼楠親緣關系最近。