miR-152基因多態性與子癇前期易感性的相關性分析

陳志琴，陳文玲，潘凌云，王慧君

(1.聯勤保障部隊第908醫院婦兒科，江西 南昌 330000；2.江西省婦幼保健院產科，江西 南昌 330000)

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種在妊娠期間發生的疾病，子癇前期的患病率在發達國家和發展中國家分別為2%～5%和10%[1]。在我國，子癇前期的患病率為8%左右，子癇前期被認為是引起產婦和新生兒死亡的主要原因之一[2]。子癇前期開始于滋養細胞的侵襲，并以內皮細胞功能的衰竭而告終。研究表明，慢性腎功能衰竭、高齡、感染、動脈硬化、胎盤屏障損傷、母體的血液循環中存在滋養細胞及慢性高血壓是發生子癇前期的危險因素[3]。子癇前期的病因包括炎癥免疫反應、內皮細胞損傷和異常胎盤浸潤等。MicroRNA(miRNA)是包含了19～25個核苷酸的單鏈RNA的小型非編碼RNA分子，能夠在廣泛的生物學過程中發揮作用[4]。miRNA與靶基因的3′-UTR區域結合以調節mRNA的表達。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能會改變miRNA的特性，從而影響其成熟度或改變其與靶標結合的能力。miRNA-152在細胞增殖、集落形成和血管生成中起作用[5]。miRNA通過靶向低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)來影響血管生成和對缺氧的反應能力[6]。HIF-1α作為miRNA-152的靶基因可調節細胞適應性，其與多種缺氧響應靶基因(如VEGF)結合。miRNA表達失調的原因之一是其基因的變異或SNP。這種多態性與該miRNA的3′-UTR區C到T的變化相關，從而影響基因的甲基化[7]。miRNA對子癇前期發生風險的影響已有相關研究，既往研究顯示miR-142、miR-126中的突變與子癇前期的發生有關[8]。本研究旨在探討miR-152 rs526487多態性與孕婦發生子癇前期的關系，為子癇前期的早期診斷及治療提供依據。

1資料與方法

1.1臨床資料

本研究納入聯勤保障部隊第908醫院2017年1月至2019年10月收治的156例診斷為子癇前期的孕婦，作為病例組；134例門診孕檢血壓正常的孕婦作為對照組。在156例子癇前期患者中，62例為輕度子癇前期，94例為重度子癇前期；100例為早發型子癇前期(妊娠34周前確診)，56例為晚發型子癇前期(妊娠34周后確診)。本研究的所有孕婦均已簽署知情同意書。子癇前期的定義：妊娠20周后出現收縮壓(systolic blood pressure，SBP)≥140mmHg和(或)舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)≥90mmHg。24h尿液中的蛋白質≥300mg或隨機尿蛋白/肌酐≥0.3，或隨機尿蛋白(+)。排除標準：患有葡萄胎、肝功能異常、慢性高血壓、潛在的腎臟疾病、多胎妊娠、子宮肌瘤、糖尿病、系統性紅斑狼瘡者。

1.2 miR-152基因的rs526487 SNP檢測

靜脈血樣品收集在含EDTA的試管中，保持在-80℃直至DNA提取。使用鹽析法提取基因組DNA。使用限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)，鑒定了miR-152 SNP rs526487的基因型，其正向和反向引物及其擴增子特性如下：5′-TGTGCGTACTGGCACTGACTGTCGTA-3′，5′-TGAC

GTGGTACTTGCGGTGACTGTCTA-3′。PCR-RFLP預混液的制備如下：最終體積為15μL，0.8μL的10μM正向和反向引物溶液，1.5μL緩沖液(10×)，0.5μL dNTP 10μM，1μL Taq DNA聚合酶，1μL DNA(100ng/μL)和0.75μL 50mM MgCl2。PCR反應程序設置如下：在95℃下變性5min，然后在95℃下進行30個循環25s，在61℃下進行20s，到72℃退火25s，最后延伸72℃ 5min。通過加入1μL緩沖液，0.3μL DdeI(Thermo，USA)消化PCR產物(8.9μL)，然后在37℃下孵育16h，在-20℃下保存。通過在80V下使用4%瓊脂糖凝膠進行凝膠電泳獲得消化的產物。

1.3統計學方法

使用SPSS 19.0對數據進行錄入、分析。多態性位點的基因型與易感性的關系采用χ2檢驗分析，多態性位點的基因型與易感性的風險分析采用二元Logistic回歸分析。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1兩組一般情況比較

病例組年齡、身體質量指數(body mass index，BMI)、身高、體重、三酯甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)比較差異均無統計學意義(P>0.05)；病例組舒張壓、收縮壓高于對照組，差異有統計學意義(t值分別為10.745、13.885，P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般情況比較Table 1 Comparison of general information between the two

2.2兩組miR-152 rs526487各基因型突變型比較

病例組miR-152 rs526487 AA基因型比例高于對照組，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于對照組，兩組各基因型所占比例差異有統計學意義(χ2=58.965，P<0.05)，見表2。miR-152 rs526487 AA基因型能增加子癇前期易感性(OR=11.429，95%CI=5.91～22.78，P<0.05)。

表2 兩組miR-152 rs526487各基因型突變型比較[n(%)]Table 2 Comparison of miR-152 rs526487 genotype mutations between the two groups[n(%)]

2.3兩組miR-152 rs526487各等位基因突變頻率比較

病例組miR-152 rs526487 A等位基因的比例高于對照組，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于對照組，差異有統計學意義(χ2=104.957，P<0.05)，見表3。miR-152 rs526487 A等位基因頻率能增加子癇前期易感性(OR=2.947，95%CI=2.282～3.898，P<0.05)。

表3 兩組miR-152 rs526487各等位基因突變頻率比較[n(%)]Table 3 Comparison of the mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between the two groups[n(%)]

2.4輕度、重度子癇前期患者的miR-152 rs526487各基因型突變型比較

重度子癇前期患者的miR-152 rs526487 AA基因型比例高于輕度子癇前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于輕度子癇前期，輕度子癇前期與重度子癇前期患者各基因型比例差異有統計學意義(χ2=48.654，P<0.05)，見表4。miR-152 rs526487 AA基因型與子癇前期的嚴重程度有關系(OR=13.685，95%CI=4.251～25.698，P<0.05)。

表4 輕度、重度子癇前期患者miR-152 rs526487各基因型突變型比較[n(%)]Table 4 Comparison of miR-152 rs526487 genotype mutations between mild preeclampsia and severe preeclampsia[n(%)]

2.5輕度、重度子癇前期患者的miR-152 rs526487各等位基因突變頻率比較

重度子癇前期患者的miR-152 rs526487 A等位基因比例高于輕度子癇前期，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于輕度子癇前期，差異有統計學意義(χ2=123.365，P<0.05)，見表5。miR-152 rs526487 A等位基因頻率與子癇前期的嚴重程度有關系(OR=2.741，95%CI=1.895～3.941，P<0.05)。

表5 輕度、重度子癇前期患者的miR-152 rs526487各等位基因突變頻率比較[n(%)]Table 5 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between mild preeclampsia and severe preeclampsia[n(%)]

2.6早發型、晚發型子癇前期患者的rs526487各基因型突變型比較

早發型子癇前期患者的miR-152 rs526487 AA基因型比例高于晚發型子癇前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于晚發型子癇前期，早發型子癇前期與晚發型子癇前期患者各基因型比例差異有統計學意義(χ2=47.547，P<0.05)；miR-152 rs526487 AA基因型與子癇前期發病時間有關系(OR=10.478，95%CI=5.20～23.698，P<0.05)，見表6。

表6 早發型、晚發型子癇前期的miR-152 rs526487各基因型突變型比較[n(%)]Table 6 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between late-onset preeclampsia and early-onset preeclampsia[n(%)]

2.7 早發型、晚發型子癇前期患者的miR-152 rs526487等位基因突變頻率比較

早發型子癇前期患者的miR-152 rs526487 A等位基因比例高于對照組，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于對照組，其等位基因頻率分布差異有統計學意義(χ2=129.365，P<0.05)，見表7。miR-152 rs526487 A等位基因頻率與子癇前期的發病時間有關系(OR=2.845，95%CI=2.012～3.998，P<0.05)。

表7 早發型、晚發型子癇前期的miR-152 rs526487等位基因突變頻率比較[n(%)]Table 7 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between late-onset preeclampsia and early-onset preeclampsia[n(%)]

3討論

3.1 miRNA與子癇前期的關系

子癇前期是妊娠期常見的并發癥，其特征是患者在妊娠20周后新發高血壓和蛋白尿。此外，子癇前期患者可能出現腎功能不全、肝臟疾病。miRNA作為妊娠期疾病的新生物標志物，其表達缺失與妊娠期疾病相關[9]。報道顯示，子癇前期患者miR-126表達減少、miR-15b表達增加，miR-126、miR-15b分別具有促血管生成和血管抑制作用[10]，miR-152具有促進細胞增殖、侵襲和血管生成的作用[11]。miR-152被認為是子癇前期的新型潛在生物標志物和治療靶標。

3.2 子癇前期患者的miR-152 rs526487多態性

近期研究表明miR-152是T輔助淋巴細胞的主要細胞因子，在調節體液免疫反應中起著關鍵作用。miR-152在懷孕期間增加[12]。miR-152基因位于5q31.1號染色體上的細胞因子基因簇內，其第三內含子有70bp的可變數目的串聯重復多態性。miR-152 rs526487多態性包含3個等位基因：AA、AG、GG；GG等位基因的頻率高于AA等位基因，AG等位基因很稀少，這在少數人群中已被證實[13]。

3.3 miR-152 rs526487多態性與子癇前期易感性的關系

miR-152 rs526487基因多態性位于miR-152基因的內含子，其可改變信使核糖核酸的剪接，導致不同的剪接變體。研究表明miR-152 rs526487 AA/GG基因型與miR-152的高表達有關，AA等位基因與miR-152的高表達之間存在關聯性[14]。這一發現支持了本研究在子癇前期患者中發現血清miR-152水平升高的結果。miR-152 rs526487多態性與多種疾病有關，如平滑肌瘤、子宮頸癌、乳腺癌、終末期腎病、系統性紅斑狼瘡(SLE)、口腔癌和川崎病[15]。本研究結果發現，病例組miR-152 rs526487 AA基因型比例、A等位基因頻率高于對照組，miR-152 rs526487 GG基因型比例、G等位基因頻率低于對照組，miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因頻率能增加子癇前期易感性，與其他研究結果[14]一致。

3.4 miR-152 rs526487多態性與子癇前期嚴重程度、發病時間的關系

本研究同時發現，重度子癇前期miR-152 rs526487 AA基因型比例、A等位基因頻率高于輕度子癇前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例、G等位基因頻率低于輕度子癇前期；miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因頻率與子癇前期患者病情有關，早發型子癇前期miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因頻率高于晚發型子癇前期，miR-152 rs526487 GG基因型、G等位基因頻率低于晚發型子癇前期；miR-152 rs526487 AA基因型、G等位基因頻率與子癇前期發病時間有關。近期研究發現子癇前期的主要誘因是缺氧，從而導致胎盤功能不全。HIF-1α是一種轉錄因子，其在胎盤中的表達隨著缺氧程度的增加而增加。目前尚無研究調查子癇前期患者中HIF-1α和miR-152表達之間的關系[16]。細胞實驗表明，在HIF-1α的靶向調節下，宮頸癌細胞中的缺氧反應誘導了miR-152表達，這對癌細胞的生長具有抑制作用。此外，miR-152 rs526487 AA的等位基因頻率與HIF-1α以及乳腺癌、哮喘的風險相關[17-19]。因此推測miR-152 rs526487 AA的等位基因頻率升高導致的子癇前期嚴重程度及發病速度增加可能與HIF-1α有關，這有待于在后續研究中進一步探究。

3.5本研究不足之處及展望

本研究為單中心病例對照研究，樣本量少，在后續研究中將進一步擴大樣本量深入探討子癇前期的病因，為該病的治療提供依據。

綜上所述，miR-152 rs526487 AA基因型和A等位基因均與子癇前期的易感性、嚴重程度、發病速度相關。