新疆地區(qū)育齡婦女葉酸代謝酶基因多態(tài)性分布的研究

錢 芳，縱瑞奇，王 軍，王志勇

(1.新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院遺傳科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)科技項目服務中心項目中心，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院檢驗科，新疆 烏魯木齊 830000；4.新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院男科，新疆 烏魯木齊 830000)

隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展和醫(yī)療服務水平的顯著提高，我國嬰兒死亡率和5歲以下兒童死亡率持續(xù)下降，危害兒童健康的傳染性疾病得到控制，但是新生兒出生缺陷問題日益凸顯。我國出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，每年新增出生缺陷約90萬例，出生缺陷已成為影響兒童健康和出生人口素質(zhì)的重大公共衛(wèi)生問題[1]。母體葉酸缺乏是引起出生缺陷的重要原因。葉酸缺乏能引起神經(jīng)管畸形、先天性心臟病等先天缺陷發(fā)生，對兒童神經(jīng)認知發(fā)育等亦可造成明顯影響[2-3]。而葉酸補充過量亦會對孕婦及胎兒造成嚴重的后果[4]。此外，亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase，MTRR)可通過影響葉酸的代謝和利用能力，從而影響出生缺陷的發(fā)生風險[5]。因此，個體化葉酸補充對改善母嬰結(jié)局具有重要的意義。本研究擬探討新疆地區(qū)漢、維、哈族育齡婦女葉酸代謝酶基因多態(tài)性分布，為新疆地區(qū)制定葉酸個性化增補方案以及出生缺陷的一級防控，提供參考依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對象

于2019年1月至2020年12月，隨機選取新疆維吾爾自治區(qū)14個縣市(庫車縣、墨玉縣、喀什市、尉犁縣、尼勒克縣、鞏留縣、富蘊縣、布爾津縣、呼圖壁縣、木壘縣、吉木薩爾縣、烏蘇市、烏魯木齊米東區(qū)和哈密市)的漢族、維吾爾族和哈薩克族的4 555例育齡婦女作為研究對象，收集其一般資料[年齡、孕次和身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)]。納入標準：①育齡期女性；②民族為漢族、維吾爾族或哈薩克族；③完成葉酸代謝酶基因多態(tài)性測定且可耐受；④知情同意參與本研究。排除標準：①精神或認知功能異常者；②存在高血壓、心臟病或腎病等慢性疾病者；③存在血液系統(tǒng)疾病、嚴重肝腎功能異常或自身免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑

Taqman-MGB探針；低溫離心機(型號：J-6BABI，購自Beckman)、7900型熒光定量PCR儀，試劑為Buffer A、Buffer B、飽和酚、氯化鈉及異丙醇等，均購自美國Applied Biosystems(AB)公司。

1.2.2檢測方法

使用乙二胺四乙酸抗凝管采集育齡婦女靜脈血樣3mL，離心30min，速度4 000rpm，分離后放置在低溫下，備用。采用熒光定量PCR技術檢測葉酸代謝酶基因多態(tài)性(MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G)。PCR反應體系總體積為10uL(包括基因組DNA 1uL、Taqman Universal Master Mix 5uL、Taqman-MGB探針0.5uL、去離子水3.5uL)。借助Primer 5.0軟件完成C677T位點特異性引物的檢測，具體方法如下：Primer F：5′-TGGTGGGCCGCAGAACATGTGC-3′(25bp)；R：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′(32bp)；設定反應條件：30℃ 10min；42℃ 30 min；99℃ 5 min；5℃ 5 min，合計完成35個循環(huán)，72℃延伸10min。將最終獲得的產(chǎn)物置于濃度為1.5%瓊脂凝膠電泳(引物由美國Invitrogen生物技術有限公司提供)。上述操作完畢后，在ABI 7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光，并借助分析軟件確定不同標本中基因分型情況。

1.3統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1一般資料比較

本研究共納入4 555例育齡婦女，其中漢族2 162(47.46%)人，維吾爾族1 376(30.21%)人，哈薩克族1 017(22.33%)人。漢族、維吾爾族和哈薩克族育齡婦女的年齡和孕次差異均具有統(tǒng)計學意義(F值分別為21.37和18.30，P<0.05)，但BMI差異不具有統(tǒng)計學意義(F=0.18，P>0.05)，見表1。

表1 漢、維、哈族育齡婦女一般資料比較Table 1 Comparison of general data among the Han，Uygur and Kazakh ethnic women of childbearing

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結(jié)果

漢族、維吾爾族和哈薩克族育齡婦女的MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G基因多態(tài)性分布均符合遺傳平衡定律(P>0.05)，表明樣本具有區(qū)域群體代表性。

2.3基因型頻率比較

漢族、維吾爾族和哈薩克族育齡婦女MTHFRC677T主要基因型分別為CT、CT和CC，MTHFRA1298C主要基因型均為AA，MTRRA66G主要基因型分別為AA、AG和AG，三者MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G基因型分布差異均具有統(tǒng)計學意義(χ2分別為537.28、192.18、381.02，P<0.05)，見表2。

表2 漢、維、哈族育齡婦女葉酸代謝酶基因的基因型頻率比較[n(%)]Table 2 Comparison of genotype frequencies of the genes of folate metabolizing enzymes among the Han，Uygur and Kazakh ethnic women of childbearing age[n(%)]

2.4等位基因頻率比較

漢族、維吾爾族和哈薩克族育齡婦女MTHFRC677T主要等位基因分別為T、C和C，MTHFRA1298C主要等位基因均為A，MTRRA66G主要等位基因均為A，三者MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G等位基因分布差異均具有統(tǒng)計學意義(χ2分別為572.72、194.48、387.33，P<0.05)，見表3。

表3 漢、維、哈族育齡婦女葉酸代謝酶基因的等位基因頻率比較[n(%)]Table 3 Comparison of allele frequencies of the genes of folate metabolizing enzymes among the Han，Uygur and Kazakh ethnic women of childbearing age[n(%)]

3討論

3.1葉酸代謝酶基因多態(tài)性的影響

出生缺陷受環(huán)境、營養(yǎng)與遺傳因素的共同影響，葉酸在維持胚胎正常發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，孕婦葉酸缺乏能引起多種出生缺陷。葉酸介導的單碳代謝途徑是染色質(zhì)甲基化、磷脂生物合成、細胞增殖以及眾多代謝物的合成和分解代謝的關鍵[6]。MTHFR是葉酸代謝的關鍵酶，可將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸(5-methyltetrahydrofolate，5-MTHF)，使之能為同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)提供甲基形成甲硫氨酸。MTHFRC677T突變導致丙氨酸被纈氨酸取代，編碼的蛋白質(zhì)具有較低的酶活性，雜合子和純合子酶活性分別降低30%和60%，導致Hcy濃度升高[7]。較高水平的母體血清Hcy可以通過上調(diào)組蛋白H3K79Hcy來調(diào)節(jié)神經(jīng)管畸形相關基因的表達[8]。MTHFRA1298C突變導致谷氨酸被丙氨酸取代，使MTHFR活性降低，但不如MTHFRC677T突變明顯[9]。MTRR對葉酸循環(huán)中DNA和組蛋白的甲基化至關重要，其能協(xié)同維生素B12維持甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，MTR)的活性，使MTR以5-MTHF為底物，催化Hcy合成甲硫氨酸。MTRRA66G突變導致甲硫氨酸被異亮氨酸取代，降低了MTR的活性，影響相關基因和通路的表觀遺傳調(diào)控，從而造成胎兒先天缺陷[10]。

3.2葉酸代謝酶基因多態(tài)性的人群分布差異

本研究顯示，新疆地區(qū)漢、維、哈族育齡婦女葉酸代謝酶基因多態(tài)性分布存在明顯的差異性。許敏等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，漢族育齡婦女MTHFRC677T等位基因突變頻率高于維吾爾族和哈薩克族育齡婦女，但MTHFRA1298C和MTRRA66G等位基因突變頻率低于維吾爾族和哈薩克族育齡婦女，與本研究結(jié)果一致。既往研究[9,12]顯示，MTHFRC677T和MTRRA66G突變頻率與緯度呈正相關，與我國出生缺陷發(fā)生率北高南低的分布一致，但MTHFRA1298C突變頻率與緯度呈負相關。本研究中漢族育齡婦女MTHFRC677T等位基因突變頻率高于陜西、湖北、廣東等地[13]。因此，葉酸代謝酶基因多態(tài)性分布存在遺傳異質(zhì)性，加之地理環(huán)境、生活方式和飲食習慣的不同，導致出生缺陷在育齡婦女中的易感性不同。新疆維吾爾自治區(qū)幅員遼闊，多民族聚居，加強新疆地區(qū)育齡婦女葉酸代謝酶基因多態(tài)性的測定，能明確新疆地區(qū)育齡女性中相關基因型和等位基因頻率等遺傳數(shù)據(jù)，以便基于群體特征開展針對性的婦幼保健服務。

3.3葉酸個性化增補方案的意義

從2009年開始，我國開始實施農(nóng)村育齡婦女免費增補葉酸預防神經(jīng)管畸形的公共衛(wèi)生政策，在降低神經(jīng)管畸形的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。然而，仍有部分孕婦增補葉酸后，胎兒發(fā)生神經(jīng)管畸形，主要是由于葉酸利用能力低下或葉酸補充過量引起。包燕等[14]基于葉酸利用能力風險等級對孕婦給予不同劑量的葉酸干預，發(fā)現(xiàn)干預后的孕婦血清Hcy水平和出生缺陷情況差異不具有統(tǒng)計學意義，表明葉酸個性化增補方案可以降低葉酸過量引起的負面健康效應，提高臨床效能。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)葉酸個體化補充劑量組的先天性心臟病、早產(chǎn)、巨大兒等發(fā)生率低于葉酸統(tǒng)一補充劑量組，妊娠結(jié)局顯著改善。此外，孕期葉酸水平還可影響子代神經(jīng)發(fā)育軌跡，較低的產(chǎn)前葉酸水平與胎兒腦細胞數(shù)量減少和腦重量減輕有關[16]。因此，葉酸個性化增補方案對預防出生缺陷、提高出生人口素質(zhì)具有重要意義。

綜上所述，新疆地區(qū)漢、維、哈族育齡婦女葉酸代謝酶基因多態(tài)性分布存在明顯的差異性，應加強葉酸代謝酶基因多態(tài)性測定，指導葉酸個性化增補方案，以降低新生兒出生缺陷發(fā)生率。