細胞穿膜肽M918偶聯抗體的表達純化及其內吞效率研究

李雪 李俊敏 張雷 李杉

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006）

細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是一類由5-30個氨基酸組成可以穿透生物膜的短肽。CPPs可攜帶各種外源物質將其遞送到細胞內［1-2］，與其他遞送方式相比，這種有效的轉運系統不受細胞類型的影響，能夠與生物活性蛋白融合表達，具有較低的細胞毒性且在完成外源物質的遞送后可降解［3］，近年來，在藥物遞送系統中得到廣泛的應用［4］。穿膜肽M918衍生自抑癌蛋白p14ARF，由22個氨基 酸（MVTVLFRRLRLRIRRACGPPRVRV） 組 成，其中含有7個帶正電荷的氨基酸，屬于陽離子CPP。M918在高濃度條件下仍不具有細胞毒性，并且可以有效的將大分子外源物質（蛋白質和肽核酸）以共價結合物或非共價復合物的形式遞送到動植物細胞中［5］。與大多數CPP相似，M918的穿膜機制主要為能量依賴的內吞機制，尤其是巨胞飲作用，不同的是M918的內吞不依賴于細胞表面的糖胺聚糖［6］。

近年來，靶向治療受到越來越多的關注。單鏈抗體（single chain antibody，scFv）分子量低（約28 kD），結構簡單，易于合成，免疫原性低，廣泛的應用于靶向遞送載體［7］。然而，由于大多數抗癌抗體及其衍生物在腫瘤組織中的滲透性較差，其遞送效率受到嚴重的限制［8］，因此需要尋找一種新的靶向遞送至腫瘤組織的方法。

在本研究中，將穿膜肽M918與靶向人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的scFv偶聯，經過純化得到重組蛋白M918-scFv，通過微量熱泳動（microscale thermophoresis，MST）技術和流式細胞儀檢測M918-scFv與HER2抗原的親和能力及內吞效率。旨在探索一種靶向遞送的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 PET-28b質粒由本實驗室保存，PET-28b-scFv-EGFP質粒由本實驗室構建、保存。穿膜肽M918基因序列由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。分子克隆所用的菌株為大腸桿菌DH5α感受態（TreliefTM5α Chemically Competent Cell，擎科生物科技有限公司，中國），表達重組蛋白所用的菌株為大腸桿菌BL21（DE3）感受態（BL21（DE3）Chemically Competent Cell，天根生化科技有限公司，中國）。HER2陽性乳腺癌細胞SK-BR-3，BT474及HER2陰性乳腺癌細胞MCF-7購于中科院上海細胞庫。

1.1.2 主要儀器 Fusion Solo S化學發光成像系統（Vilber，法國）；BioLogic LP低壓層析儀（BIO-RAD，美 國 ）；T100TMThermal Cycler PCR儀（BIO-RAD，美國）；SK-ⅡD超聲波細胞破碎儀（寧波歐藍，中國）；Accuri C6 plus 分析型流式細胞儀（BD，美國）；MO NT.115相互作用分析儀（Nano Temper，德國）；激光共聚焦顯微鏡（ZEISS，美國）。

1.2 方法

1.2.1 重組PET-28b-M918-scFv-EGFP質粒的構建 根據M918和scFv-EGFP的基因序列，用Premier 5軟件設計基因擴增所需的引物（表1），由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。利用overlap PCR技術將基因片段M918與scFv-EGFP連接，以獲得M918-scFv-EGFP基因片段。PCR產物回收后，用限制性核酸內切酶Nde Ⅰ和Hind Ⅲ分別雙酶切PET-28b質粒和純化回收后的M918-scFv-EGFP基因，酶切產物回收后用T4連接酶進行連接，并將連接產物用化學轉化法轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在卡那霉素抗性（終濃度為50 μg/mL）的LB固體培養基上培養過夜。挑選陽性轉化子用通用引物進行菌落PCR鑒定并送天一輝遠基因公司測序進行更進一步的驗證，保存測序結果與目的基因比對正確的質粒并命名為PET-28b-M918-scFv-EGFP。

表1 擴增M918-scFv基因片段所需引物Table 1 Primers used to amplify M918-scFv

1.2.2 重組蛋白M918-scFv的表達、純化 將上一步中測序結果正確的PET-28b-M918-scFv-EGFP質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，并接種于卡那抗性的LB液體培養基中，37℃ 220 r/min培養過夜作為種子液。按1∶100的比例轉接種子液并培養至OD600≈1.5，向各組培養液中分別加入終濃度為300、500、800、1 000 μmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）誘導蛋白表達，16℃ 130 r/min誘導過夜。比較在IPTG濃度不同時，重組蛋白M918-scFv-EGFP的表達情況，篩選出誘導M918-scFv-EGFP表達的最適IPTG濃度。用篩選出的最適IPTG濃度誘導重組蛋白大量表達，誘導結束后4℃ 6 700 r/min離心20 min 收集菌體，菌體沉淀可于-20℃保存。

用鎳親和層析純化重組蛋白M918-scFv-EGFP。向收集到的菌體中加入適量的裂解緩沖液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L磷酸鈉，20 mmol/L咪唑和2%（V/V）Tween-20，pH 6.8）充分重懸菌體，冰上超聲破碎菌體（變幅桿Φ6、功率50%，超聲1 s開、1 s關，40 min）。超聲破碎結束后，4℃ 6 700 r/min離心30 min收集上清。將上清加載到預先用結合緩沖液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L磷酸鈉，20 mmol/L咪唑，pH 6.8）平衡好的Ni-NTA（Cytiva）上，緩慢梯度洗脫（20 mmol/L磷酸鈉，0.5-1 mol/L NaCl，20-500 mmol/L咪唑，pH 6.8）目的蛋白。用SDS-PAGE檢測純化后的蛋白。純化得到的蛋白經1×PBS透析和PEG-20000濃縮后，用BSA試劑盒測定蛋白濃度，Western Blot對獲得的蛋白進行進一步的鑒定。

1.2.3 細胞培養 SK-BR-3和MCF-7細胞均置于含1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清的DEME高糖培養基中，BT474細胞置于含1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清的1640培養基中，在5% CO2，37℃的細胞培養箱中培養。待細胞增殖到適宜密度后進行擴大培養并進行試驗。

1.2.4 HER2抗原結合實驗 用Monolith NT.115儀通過MST技術評估純化得到的scFv和M918-scFv與HER2抗原的結合能力。因為重組蛋白本身帶有綠色熒光蛋白，因此儀器可根據GFP的熒光信號，檢測抗原與重組蛋白scFv、M918-scFv結合后熱泳信號的變化。用MST緩沖液（20 mmol/L 磷酸鈉，50%（m/V）BSA，0.05%（V/V）Tween-20，pH 7.4） 配置100 nmol/L的scFv和M918-scFv溶液。將HER2抗原從400 nmol/L開始進行半倍稀釋成16個梯度，與等體積的重組蛋白混合均勻并轉移至毛細管中。將毛細管置于儀器中，在藍光激發，LED power 20%的條件下進行測試。

1.2.5 內吞效率檢測 用流式細胞儀檢測細胞表面平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）。將處于對數生長期的細胞，以5×105個/mL的密度接種于6孔板中，各接種兩板。37℃ 5% CO2培養24 h。分別向每孔中加入60 μg重組蛋白scFv和M918-scFv，并設置未加蛋白的孔做空白對照，4℃培養1 h。培養結束后，用提前預冷的1×PBS清洗。清洗結束后，各取一板細胞用流式細胞儀檢測其細胞表明MFI，另一組細胞37℃繼續培養2 h。培養結束后，用流式細胞儀檢測其表面MFI，即可根據公式計算出重組蛋白的內吞效率［9］。

內吞（%）=（4℃表面總 MFI-37℃表面總MFI）/（4℃表面總 MFI）×100 %

用激光共聚焦顯微鏡觀察M918-scFv的內吞。將3種細胞按5×103個/mL的密度接種在激光共聚焦皿中 37℃培養 24 h。加入 500 μL 5 μg/mL 的Hoechst 33342室溫孵育30 min，孵育結束后用提前預熱的培養基洗3次。再用過量的scFv和M918-scFv處理細胞，4、37℃孵育結束后，用激光共聚焦觀察細胞。

1.2.6 數據分析 所有數據均進行3次獨立重復實驗，結果以平均值和標準偏差表示。用軟件GraphPad Prism 7.0分析數據，使用軟件中單邊t檢驗，檢驗實驗不同組之間的顯著性差異，其中P＜0.05認為差異有統計學意義，P＜0.01認為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 PET-28b-M918-scFv-EGFP表達載體的構建

通過overlap PCR將穿膜肽M918基因片段與scFv基因片段連接，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1-A所示，目的片段在1 500 bp處，與M918-scFv分子量（約1.58 kb）大小相符，說明目的基因M918-scFv擴增成功。經雙酶切、連接、轉化后挑選適量個數的陽性轉化子做菌落PCR，以驗證載體構建結果。如圖1-B所示，菌落PCR片段與預期值相符，測序結果與目的基因序列一致，說明PET-28b-M918-scFv-EGFP表達載體構建成功。

圖1 重組質粒PET-28b-M918-scFv-EGFP的構建Fig.1 Construction of recombinant plasmid PET-28b-M918-scFv-EGFP

2.2 M918-scFv蛋白的純化

用Western Blot檢測（anti-His tag 抗體）優化誘導劑濃度結果如圖2-A 所示，重組蛋白M918-scFv在上清和沉淀中均有表達，隨著IPTG濃度的增加，目的蛋白的總表達量也會相應的提高，但上清中目的蛋白的含量呈先升高后降低的趨勢，當IPTG濃度為800 μmol/L時，目的蛋白在上清中的表達量最高。

用篩選出的最適IPTG濃度誘導重組蛋白大量表達，并通過Ni-NTA進行純化。在梯度洗脫過程中，在20% Buffer B洗脫時有目的蛋白（分子量約為57 kD）被洗脫下來，40% Buffer B洗脫時目的蛋白被大量洗脫，但此時雜蛋白較多。隨著洗脫的繼續進行，雜蛋白含量逐漸減少，此時目的蛋白純度較高（圖2-B）。

圖2 重組蛋白M918-scFv-EGFP的純化Fig.2 Purification of recombinant protein M918-scFv

將收集的60% Buffer B至100% Buffer B洗脫的重組蛋白，在含20%（V/V）丙三醇的1×PBS中透析24 h，用PEG-20000和超濾管濃縮蛋白，結果如圖3所示。用BCA試劑盒測定重組蛋白M918-scFv的濃度為537.6 μg/mL；用軟件Image J進行灰度值分析，蛋白純度為90.5%，符合后續生物學活性驗證標準。

圖3 Western Blot鑒定純化后的重組蛋白M918-scFFig.3 Identification of the purified recombinant protein M918-scFv by Western Blot

2.3 scFv、M918-scFv與HER2抗原的相互作用

scFv和M918-scFv與HER2抗原的結合解離常數Kd擬合曲線如圖所示4，HER2抗原與scFv、M918-scFv的 Kd值 分 別 為（8.26±2.51）×10-9mol/L和（8.41±1.58）×10-9mol/L，且信噪比均大于5。scFv和CPP-scFv的Kd值都在10-9這一數量級，說明M918-scFv偶聯穿膜肽后并不會影響scFv與Her2抗原的結合，M918-scFv保留了scFv特異性靶向HER2的能力。

圖4 scFv（A）和M918-scFv（B）與HER2抗原的結合曲線Fig 4 Binding curve of scFv（A）and M918-scFv（B）to HER2 antigen

2.4 scFv、M918-scFv的內吞效率

用流式細胞儀定量計算重組蛋白的內吞效率，在4℃條件下培養細胞，細胞處于禁止外源物質內化進入狀態，重組蛋白附著在細胞表面，而當在37℃條件培養細胞時，細胞處于允許外源物質內化進入細胞狀態，重組蛋白可通過抗原抗體相互作用和穿膜肽的穿膜特性進入細胞內。因此細胞表面結合重組蛋白的內吞效率可通過37℃樣品相對于4℃對照樣品的MFI降低水平得到［10］。實驗結果如圖5所示，HER2陽性細胞與重組蛋白scFv、M918-scFv經過4℃孵育，再轉移至37℃培養后，細胞表面的MFI均有一定程度的降低（圖5-A、B），其中M918-scFv的效果更顯著，在SK-BR-3和BT474中其內吞效率分別是scFv的1.8倍和1.5倍（圖5-D）。而在HER2陰性細胞MCF-7中，由于細胞表面缺少HER2抗原，因此重組蛋白scFv、M918-scFv處理后細胞表面的MFI沒有明顯的變化。說明scFv、M918-scFv都是通過HER2特異性結合來結合細胞的，且通過偶聯穿膜肽可以提高scFv的內吞。

圖5 流式細胞儀檢測scFv、M918-scFv在不同細胞系中的內吞效率Fig.5 Uptake studies of scFv and M918-scFv into different cell lines detected by flow cytometry

激光共聚焦顯微鏡觀察結果與流式細胞儀檢測結果相同。如圖6所示，在HER2陽性細胞SKBR-3和BT474中，4℃孵育后，重組蛋白在細胞周圍有明顯的聚集；37℃孵育后，觀察到明顯的內吞，重組蛋白均勻的分布在細胞質中。在MCF-7細胞中，則觀察不到重組蛋白的聚集。

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察scFv、M918-scFv在SKBR-3（A）、BT474（B）、MCF-7（C）中的內吞Fig.6 Uptake studies of scFv，M918-scFv into SK-BR-3（A），BT474（B） and MCF-7（C）cells observed by confocal laser scanning microscopy

3 討論

CPPs自發現以來，就在藥物遞送領域得到了廣泛的關注和應用。然而CPPs不受細胞類型的影響，未經修飾的CPP作為藥物遞送載體存在靶向性差，靶細胞攝取率低等問題，單憑CPPs無法使藥物定向蓄積，使作用于靶細胞或靶組織的藥物濃度減少，對正常組織損傷較大，限制了其作為藥物載體的應用［11-12］。抗體能特異性識別腫瘤細胞靶分子，可將一定量的抑癌藥物富集到腫瘤組織中，具有特異性高、性質均一及針對特定靶點定向制備等優點。由于單克隆抗體本身存在著篩選周期長，篩選效率低等問題，使其成為治療的瓶頸［13］。scFv和傳統的抗體相比具有顯著的優勢，即保持了原抗體的結合位點，又降低了一般異源性抗體的免疫反應，易于進行分子改造等優點［14］。

為此本研究利用抗體的靶向性及CPP的穿膜性能，使用基因工程手段將穿膜肽M918與靶向HER2的scFv偶聯，構建了原核表達質粒。scFv是由全抗的重鏈可變區和輕鏈可變區組成的，不含Fc段。在蛋白表達過程中很容易形成“包涵體”沉淀表達［15］。低溫誘導可降低目的蛋白的合成速率，從而增加目的蛋白的可溶性。誘導劑IPTG的濃度也會影響目的蛋白的溶解性。因此通過實驗優化了融合蛋白上清表達的最適IPTG濃度，使重組蛋白主要在上清中表達并純化了重組蛋白M918-scFv，獲得的蛋白濃度及純度均符合生物學驗證標準。

MST實驗結果表明穿膜肽與scFv偶聯，不會影響抗體與抗原的相互作用。流式細胞儀及激光共聚焦實驗結果表明偶聯M918后，重組蛋白仍通過HER2特異性結合來結合細胞使重組蛋白M918-scFv獲得了scFv的靶向性，解決了穿膜肽靶向性差的問題。同時在穿膜肽M918的作用下，提高了scFv在HER2陽性細胞中的內吞效率，重組蛋白M918-scFv兼具了穿膜肽的穿膜效率。與許多傳統的穿膜肽相比，M918含有7個帶正電的氨基酸，同時具有很低的兩親性，內吞不依賴于細胞表面的糖胺聚糖，因此更容易內化到細胞內，并且M918在遞送蛋白質等大分子物質時表現出最佳的傳遞特性［16］。因此融合蛋白M918-scFv表現出良好的內吞效率。

4 結論

本研究將穿膜肽M918與靶向HER2的scFv偶聯，成功的表達并純化出重組蛋白M918-scFv。與單獨的scFv相比，重組蛋白M918-scFv不僅表現出M918肽的穿膜特性，內吞效率顯著提高，同時還保留了scFv的靶向性，重組蛋白能夠靶向遞送至HER2陽性乳腺癌細胞中。