PDK4對山羊肌內(nèi)脂肪細胞脂代謝的影響

張浩 張亞楠 李鑫 王佳美 王永 朱江江 熊燕林亞秋

（1. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部四川省重點實驗室，成都 610041；2. 西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041）

肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）含量是影響肉質(zhì)的重要指標，它的提高有助于提高肉的嫩度及多汁性并改善肉質(zhì)及風味［1］。脂肪組織是一類結(jié)締組織，包括前體脂肪細胞、脂肪細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞以及白細胞等不同的細胞類型［2］。而通過控制脂肪沉積水平進一步提升肉質(zhì)水平是改善肉質(zhì)的重要手段，也是當前畜牧工作者關(guān)注的熱點。

丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDKs）是一類三磷酸腺苷酶，通過編碼具有組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域來抑制丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性，從而控制丙酮酸脫羧轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶5A［3］。PDKs具有PDK1、2、3和4這4種同工酶［4］，其中PDK4在各種代謝過程中發(fā)揮重要作用，比如在肝臟中可以通過PPARα或TR-RXR異二聚化使PDK4表達上調(diào)，且PPARα激活后存在PDK4的優(yōu)先表達［5］；人骨骼肌中PDK4在機體長期運動、短期高強度和長期低強度運動之后其 mRNA顯著增加［6］，說明PDK4影響骨骼肌代謝；同時PDK4與高血糖、胰島素抵抗、過敏和癌癥在內(nèi)的代謝疾病有關(guān)［7］。除此之外，PDK4在脂代謝中的作用也有報道，章琳俐等［8］通過RNA-seq揭示PDK4是鴨肉風味相關(guān)的候選基因，可能調(diào)節(jié)鮮味氨基酸和脂肪酸形成。Yamaguchi等［9］指出PDK4表達存在晝夜變化，這種變化與血漿游離脂肪酸（FFA）的利用有關(guān)。Newhardt等［10］通過構(gòu)建心臟糖酵解的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠的 PDK4表達升高。潘鵬丞等［11］鑒定PDK4在陸川豬皮下脂肪中高表達，Zhang等［12］在豬和小鼠肌肉中特異性過表達PGC-1α后，PDK4和PPARγ蛋白表達增加，可能促進糖原沉積和脂肪酸氧化。Xu等［13］通過測序比較圩豬和約克夏豬背最長肌中的基因表達模式，指出PDK4可能對肌內(nèi)脂肪積聚有影響。以上研究證明PDK4在脂代謝和脂肪沉積方面發(fā)揮作用，但其對山羊脂肪細胞脂代謝的影響尚不清楚，且作用機制尚未探明。

因此本研究在克隆山羊PDK4 基因序列的基礎(chǔ)上，分析其分子特征；使用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）繪制PDK4基因在山羊各組織中和肌內(nèi)脂肪細胞分化時的表達圖譜；采用干擾和過表達手段探究PDK4對脂肪細胞脂代謝的影響，為深入研究該基因調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細胞脂代謝提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機選取8頭健康的一周歲簡州大耳羊公羊（四川簡陽大哥大牧業(yè)有限公司），空腹屠宰后采集樣品：內(nèi)臟（心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟）、皮下脂肪和肌肉（背最長肌、股二頭肌和臂三頭?。┑葮颖?，用TRIzol法提取各組織中的總RNA，按TIANGEN FastQuant RT Kit（with gDNase）反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

將本實驗室前期凍存的山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞復(fù)蘇，培養(yǎng)至F3代時接種于12孔板，待細胞融合度達到90%時加入終濃度為50 μmol/L的油酸的完全培養(yǎng)基誘導細胞分化，分別收集分化0-7 d的肌內(nèi)脂肪細胞（n=3），TRIzol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

1.2 方法

1.2.1 山羊PDK4克隆及分子特征分析 使用Primer 5.0 軟件根據(jù) NCBI中牛 PDK4的預(yù)測序列（NM_001101883.1）設(shè)計山羊PDK4 的克隆引物。以來自皮下脂肪組織的cDNA 為模板進行擴增。按cDNA 1.0 μL，sense/anti-sense primer（10 μmol/L）1.0 μL，2×GC-Rich PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O補齊體系至 25 μL。程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35 個循環(huán) ；72℃延伸 10 min。從1%瓊脂糖凝膠中回收目的片段，連接至pMD-19T載體后轉(zhuǎn)化至DH5α，挑取陽性菌落送擎科生物科技有限公司測序。

利用生物信息學軟件對山羊PDK4的理化性質(zhì)，磷酸化位點，信號肽及亞細胞定位，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進行分析，具體方法參照文獻［14］。

1.2.2 山羊PDK4過表達和干擾細胞模式的構(gòu)建 將本實驗室前期構(gòu)建保存山羊HBADE-PDK4-3*flag-GFP過表達載體和HBAD-GFP對照載體滴加入12孔板中感染12 h，然后更換培養(yǎng)基為誘導液，收集誘導分化48 h的脂肪細胞。接種于12孔板的細胞待融合度達到80%-90%每孔加入450 μL Opti-MEM培養(yǎng)液，然后在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，按每孔 3 μL Lipo3000，2 μL 20 μmol/L siRNA，50 μL Opti-MEM體系配置預(yù)混液，室溫靜置15 min后加入孔中，轉(zhuǎn)染6 h后更換終濃度為50 μmol/L油酸的完全培養(yǎng)液，48 h后收集細胞。

1.2.3 油紅O染色及OD值檢測 用于染色的細胞接種于24孔板，細胞處理同1.2.2，對應(yīng)病毒感染用量和干擾轉(zhuǎn)染體系均減半處理，48 h后進行油紅O染色及OD值檢測，PBS洗滌3次后用10%中性甲醛固定30 min，PBS洗凈甲醛后加入配制好的油紅O工作液，染色30 min后PBS洗凈浮色，置于顯微鏡下觀察并拍照。然后每孔加入1 mL異丙醇，溶解染料后轉(zhuǎn)移至96孔板并測定其吸光度值。

1.2.4 熒光定量PCR 及數(shù)據(jù)分析 利用qPCR檢測PDK4在山羊各組織中和山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化過程中的表達水平。用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異性引物（表1），以TBP（XM_018053502.1）作為內(nèi)參基因，qPCR反應(yīng)體系包括cDNA 1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL，RNase Free H2O 7 μL。反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，59℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。利用2-ΔΔCT法分析qPCR結(jié)果，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤（Mean±SEM）”展示，使用SPSS 18.0 軟件并選擇One-way ANOVA方法分析數(shù)據(jù)差異顯著性，mRNA相對表達量以Duncan 法進行多重比較。當 P＜0.05 時，認為有統(tǒng)計學意義。“*”表示差異顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01）。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果

2.1 山羊PDK4的生物學特性

克隆獲得山羊PDK4基因長 1 808 bp（GenBank登錄號：MF564045.1），其中CDS區(qū)長1 224 bp，可編碼407個氨基酸，預(yù)測蛋白分子質(zhì)量為46.2 ku（圖1-A）。NCBI conserved Domains Batch Search分析發(fā)現(xiàn)PDK4蛋白含有HATPase_PDK-like和BCDHK_Adom3結(jié)構(gòu)域（圖1-B），主要定位在線粒體（47.8%）和細胞質(zhì)（30.4%），理論等電點6.43，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測PDK4 蛋白包含52.09%無規(guī)則卷曲（212個氨基酸）、31.45% α螺旋（128個氨基酸）和16.46%延伸鏈（67個氨基酸）（圖1-C）。STRING數(shù)據(jù)庫顯示DLAT、PDHA1、PDP2、PDK2、DLD、PDHB 和 PDHA1 等蛋白與PDK4存在相互作用（圖1-D）。

圖1 山羊PDK4序列分析Fig. 1 Sequence analysis of goat PDK4

2.2 同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析

山羊PDK4氨基酸序列與綿羊、牛、豬、人、小鼠的同源性均在90%以上（圖2-A），利用MAGE5構(gòu)建PDK4的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖2-B）顯示山羊與綿羊和牛處于同一分支，親緣關(guān)系最近。

圖2 山羊PDK4同源性分析（A）和進化樹（B）Fig. 2 Homology analysis（A）and phylogenetic tree（B）of goat PDK4

2.3 山羊PDK4組織和細胞表達模式

qPCR結(jié)果顯示PDK4在山羊肺臟和臂三頭肌的表達量極顯著高于其他組織（P＜0.01），其次為肝臟，極顯著高于心臟、脾臟、腎臟、瘤胃和皮下脂肪組織（P＜0.01）（圖3-A）。PDK4在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化過程中表達呈上升趨勢，且在第5天時的表達量最高，極顯著高于分化前的表達量（P＜0.05）（圖 3-B）。

圖3 山羊PDK4組織表達譜（A）和時序表達譜（B）Fig. 3 Tissue expression profile（A）and temporal expression profile（B）of goat PDK4

2.4 PDK4對山羊肌內(nèi)脂肪細胞脂代謝的影響

2.4.1 過表達和干擾效率檢測 分別以不同濃度的山羊PDK4腺病毒過表達載體和空白對照的腺病毒感染山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞，誘導分化48 h后在利用顯微鏡觀察細胞處于正常狀態(tài)的基礎(chǔ)上，收集細胞并提取總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR檢測其過表達效率，結(jié)果（圖4）顯示過表達PDK4基因后，與對照相比，PDK4基因過表達效率大約為307.9倍（P＜0.01）。

圖4 PDK4過表達（A）和干擾（B）效率Fig. 4 Efficiency of PDK4 overexpression（A）and inter-ference（B）

兩對siRNA（siPDK4-1和siPDK4-2）轉(zhuǎn)染組與同對照組相比均極顯著地降低目的基因的表達，干擾效率分別為56%和67%（P＜0.01）。siPDK4-2的干擾效率高于siPDK4-1的干擾效率，因此本研究后期均以siPDK4-2作為有效干擾片段進行研究。

2.4.2 形態(tài)學觀察 過表達PDK4后肌內(nèi)脂肪細胞中的脂質(zhì)積聚顯著高于陰性對照組（圖5-A），同時進行OD值檢測，發(fā)現(xiàn)OE-PDK4組的OD值顯著高于陰性對照組（P＜0.05）（圖5-B）。

轉(zhuǎn)染siPDK4-2 48 h后細胞形態(tài)未發(fā)生改變，但脂滴聚積明顯減少（圖5-C），干擾后OD值顯著低于對照組（圖5-D）。

圖5 油紅O染色及OD值Fig. 5 Oil red O staining and OD value

2.4.3 脂代謝相關(guān)基因表達水平檢測 過表達PDK4后，與對照相比，OE-PDK4組脂肪酸合成基因ACACA mRNA，脂質(zhì)吸收及轉(zhuǎn)運基因FABP3和CD36、甘油三酯合成基因AGPAT6和ADRP mRNA表達極顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖6-A）。而干擾PDK4后與NC相比，F(xiàn)ABP3、AGPAT6 mRNA表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05），CD36、ACACA、ADRP mRNA 表達極顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖6-B）。

圖6 脂代謝相關(guān)基因表達水平Fig. 6 Expression levels of lipid metabolism-related genes

3 討論

本研究獲得山羊PDK4 DNA序列1 808 bp，包含編碼407個氨基酸的CDS區(qū)序列1 224 bp，序列分析顯示，山羊PDK4蛋白共有36個潛在磷酸化位點和22個潛在糖基化位點，這可能與蛋白質(zhì)翻譯后修飾有關(guān)［15］，從而激活PDK4的活性發(fā)揮其自身的調(diào)控作用。PDK4蛋白在不同物種間存在差異，而氨基酸序列的差異是否會導致其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，引起其功能的變化以及在不同物種間的功能是否有變化仍需進一步證明。

PDK4組織表達譜顯示PDK4在山羊肺臟和臂三頭肌中的相對表達水平最高，顯著高于檢測的其它組織中的表達，而有研究顯示PDK4在動物心臟、氧化型肌肉、肝臟和腎臟等組織中高表達［16-17］；PDK4在榮昌豬仔豬的多種組織中表達，且在小腸中高表達，在腎臟、脾臟和脂肪組織中也存在較高水平的表達［18］，這與本研究結(jié)果存在差異。楊洋等［19］報道 PDK4基因在大白豬和從江香豬兩個品種中的脂肪組織中均存在較高水平的表達，但在從江香豬的腎臟中表達水平最高，與本研究結(jié)果類似，也表明PDK4在不同品種中存在差異；張榕婧等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PDK4在雞的肌肉組織中表達量最高，這與上述報道存在差異，但與本實驗結(jié)果相似，推測PDK4在不同物種中具有不同的表達模式。此外，PDK4在巴馬香豬和杜長大豬兩個品種的腹部脂肪組織中表達量最高，其中杜長大豬的皮脂、腹脂、肝、脾以及腎中PDK4基因的表達水平較高［20］；但奚子英等［21］對肉雞的研究中發(fā)現(xiàn)，PDK4基因在雞的皮脂和腹脂中的表達水平顯著高于下丘腦和肝臟中的表達水平?；赑DK4在不同物種脂肪組織中的高表達，本研究構(gòu)建了山羊肌內(nèi)脂肪細胞時序表達譜，顯示PDK4在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化過程中表達呈現(xiàn)上升趨勢，推測山羊PDK4可能具有促進肌內(nèi)脂肪細胞脂質(zhì)積聚的作用。這與張罕星等［22］報道相似，PDK4在豬肌內(nèi)和皮下脂肪細胞分化過程中表達水平均呈逐漸上升的趨勢，推測PDK4在脂肪細胞分化和脂質(zhì)積聚過程中可能扮演重要角色。Schafer等［23］發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中CoA（CoASH）促進PDK4的降解，充當將PDK4降解速率與心臟中的脂肪酸利用率相關(guān)聯(lián)的代謝傳感器，間接指出PDK4在脂代謝中的調(diào)控作用。因此，為了明確PDK4是否調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細胞脂代謝，本研究后續(xù)采用干擾及過表達實驗進行闡明。

研究發(fā)現(xiàn)過表達PDK4促進了肌內(nèi)脂肪細胞脂質(zhì)的積聚，而干擾山羊PDK4抑制了肌內(nèi)脂肪細胞脂滴的積聚，但脂肪細胞分化標志基因沒有發(fā)生改變（數(shù)據(jù)未展示），這與Sarsenbayeva等［24］的報道相類似，Sarsenbayeva等發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)線粒體功能的PGC1α、PDK4和CPT1B基因受藥物作用表達降低，可影響人皮下脂肪組織的脂代謝，卻對脂肪因子Leptin和AdipoQ的表達無影響，對PPARγ也無影響?；诖耍覀兛紤]PDK4是否通過調(diào)控脂代謝相關(guān)基因表達變化來完成促進脂滴積聚的作用，因此檢測了脂代謝相關(guān)基因FABP3、CD36、AGPAT6、ADRP和ACACA表達水平的變化。FABP3是脂肪酸結(jié)合蛋白家族（FABPs）成員之一，主要通過促進甘油三酯沉積影響脂質(zhì)代謝［25-26］，抑制FABP3基因后明顯抑制葡萄糖氧化從而促進細胞內(nèi)甘油三酯合成［27］，另外FABP3可協(xié)同ACSL2基因?qū)㈤L鏈脂肪酸酯化形成甘油三酯［28］。CD36可作為脂肪酸轉(zhuǎn)運體介導組織細胞對脂肪酸的攝取，參與脂肪酸代謝［29］。磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶6（1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase6，AGPAT6）來自 AGPAT家族，在多種哺乳動物中參與甘油三酯和三?；视蜕锖铣桑?0］。AGPAT6基因缺失小鼠的遺傳性肥胖的幾率降低［31-34］。ADRP基因可促進脂肪細胞脂肪的合成［35-36］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達山羊PDK4可使脂代謝相關(guān)基因FABP3、CD36、ACACA、AGPAT6和ADRP mRNA表達發(fā)生變化，其隨著PDK4基因的上調(diào)而呈顯著增高。干擾PDK4后FABP3、AGPAT6、ADRP和CD36基因的表達呈現(xiàn)相反的表化，推測PDK4可能通過調(diào)節(jié)FABP3、AGPAT6、ADRP、ACACA和CD36基因表達促進山羊肌內(nèi)脂肪細胞脂代謝。但是PDK4調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細胞脂代謝的具體分子機理仍不清楚，需要進一步的研究來闡明。

4 結(jié)論

山羊PDK4基因在山羊各組織及肌內(nèi)前體脂肪細胞分化各個階段均有表達；過表達后促進了脂肪細胞脂滴積聚，甘油三酯合成和脂質(zhì)沉積相關(guān)基因表達上調(diào)，而干擾后呈現(xiàn)相反的趨勢和表達，表明PDK4切實影響山羊肌內(nèi)脂肪細胞的脂質(zhì)沉積。