七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道微生物及酶活性的影響

謝果珍 唐圓 吳儀 黃莉莉 譚周進

（湖南中醫藥大學，長沙 410208）

腸道微生物是腸道微生態的重要組成部分，據統計，哺乳動物腸道中棲息著種類超過1 000種，數量超過40萬億的微生物［1］。腸道微生物可產生各種代謝酶參與代謝機體所攝入的食物及藥物，并生成營養物質和生物活性成分影響人體健康，被視為機體不可或缺的“代謝器官”［2］。研究表明，藥物與腸道微生物間存在復雜的相互作用：一方面，藥物進入體內會影響腸道微生物的組成及功能，進而導致酶的數量及活性發生改變；另一方面，腸道微生物與酶參與藥物的代謝，影響藥物的療效與副作用［3-4］。因此，越來越多的研究者認為腸道微生物可能是藥物的作用靶點［5-7］。研究藥物對腸道微生物及酶的影響有助于從腸道微生態角度評價藥物的療效及探明藥物的作用機理。

七味白術散出自北宋錢乙所著的《小兒藥證直訣》，主治脾虛泄瀉，在現代臨床上亦常用于治療多種原因所致的腹瀉［8］。中藥的療效是多成分、多靶點、多途徑共同作用的結果。課題組前期從腸道微生物及腸道酶活性等角度研究了七味白術散對菌群失調腹瀉小鼠的影響，發現七味白術散可促進乳酸菌（Lactobacilli）、酵母菌（Saccharomyces）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）等有益菌的增殖，抑制艱難梭菌（Clostridium difficile）等致病菌和大腸桿菌（Escherichia coli）等條件致病菌的生長，另外提高了淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶及乳糖酶的活性，降低了木聚糖酶及蛋白酶的活性，對腸道微生態有較好的調節作用［9-11］。然而七味白術散治療腹瀉的物質基礎尚不明確。

在臨床上七味白術散以口服為主，其水煎液的主要成分為極性較大的苷類及多糖類。苷類化合物是中藥重要的活性成分之一，在心血管系統、呼吸系統、消化系統、神經系統、免疫系統等表現出廣泛的藥理活性。研究顯示葛根素改善腹瀉型腸易激綜合征［12］、人參皂苷改善非酒精性脂肪肝［13］、黃芩苷改善結腸炎［14］及肉蓯蓉總苷抗抑郁［15］的作用與調節腸道菌群、恢復腸道穩態有關。現有研究多提取單味中藥的苷類成分進行藥效藥理研究，而對中藥復方總苷類成分的研究較少。為進一步揭示七味白術散治療腹瀉的物質基礎，本研究從七味白術散中提取分離得到總苷類成分，探究七味白術散總苷對腸道微生物及酶活性的影響，以期為七味白術散治療菌群失調腹瀉的物質基礎及作用機理提供佐證，為從腸道微生態角度評價中藥復方的有效物質提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 202-2AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），都市主婦全能小鋼磨（永康市鉑歐五金制品有限公司），RE-2000B旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器有限公司），KQ5200DE超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（上海亞榮生化儀器有限公司），HA-600三用恒溫水箱（金壇市神科儀器廠），FD5-3真空冷凍干燥機（金西盟（北京）儀器有限公司），Nano-drop 2000/2000C紫外分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司），高速冷凍離心機1850R（湖南湘儀儀器有限公司），恒溫搖床培養箱（金壇榮華儀器制造有限公司），電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.1.2 藥材與試劑 土炒白術（湖南，批號：20201014）、人參（東北，批號：20200610）、木香（云南，批號：20201011）、甘草（內蒙古，批號：20200610）、廣藿香（廣東，批號：20200816）、葛根（湖南，批號：20201020）、茯苓（湖南，批號：20201109）購于湖南省弘華中藥飲片有限公司，經湖南中醫藥大學潘清平教授鑒定為正品。

頭孢拉定膠囊（06200502，通化萬通藥業股份有限公司），硫酸慶大霉素注射液（01Y07011A2，宜昌人福藥業）。無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司，熒光素二乙酸（fluorescein diacetate，FDA）、鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG），購于上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性昆明（KM）小鼠30只，體重為（20±2）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［SCXK（湘）2019-0004］。小鼠購回后于室溫20-22℃，相對濕度50%-70%環境下分籠飼養，自由取食及飲水。小鼠普通維持飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。本研究通過湖南中醫藥大學動物實驗福利倫理審查（LL2020071001）。

1.2 方法

1.2.1 七味白術散水煎液的制備 按七味白術散處方用量［16］稱取各藥飲片，加10倍量蒸餾水浸泡30 min，武火煮沸后小火煎煮30 min，紗布過濾，煎煮2次，合并水煎液，濃縮至生藥濃度為0.34 g/mL，4℃保存備用。

1.2.2 七味白術散總苷的制備 七味白術散總苷按課題組優化的提取工藝制備，即按比例稱取七味白術散各味藥粉碎后過60目篩的粉末，加14倍量的蒸餾水，煎煮2次，每次煎煮53 min，合并水煎液，濃縮至一定體積后加無水乙醇，使乙醇終濃度為75%，攪拌均勻后4℃靜置過夜。乙醇提取液濃縮后依次用石油醚脫脂3次，水飽和正丁醇萃取3次。正丁醇萃取液減壓濃縮至一定體積后水浴蒸干，再冷凍干燥后得到七味白術散總苷粉末。七味白術散總苷的提取率為1.48%。

七味白術散總苷提取率（%）=七味白術散總苷粉末量（g）/七味白術散全方粉末量（g）× 100%。

1.2.3 FDA的制備 稱取6 mg FDA，加3 mL丙酮，制得2 mg/mL的FDA儲備液，置于棕色瓶中避光保存［17］。

1.2.4 動物分組及造模 小鼠適應性飼養3 d后隨機分成正常組（5只，N）和模型組（25只）。模型組小鼠灌胃混合抗生素，即取6支硫酸慶大霉素注射液（2 mL/支）及3粒頭孢拉定膠囊（0.25 g/粒），配成濃度為62.5 g/L的抗生素混合液，0.4 mL/只/次，每天2次，共5 d，模型組小鼠糞便變得稀濕，即為造模成功。正常組小鼠給予等體積無菌水［11］。

1.2.5 給藥 造模成功后將模型組小鼠隨機分為自然恢復組（R）、七味白術散水煎液組（TW）、七味白術散總苷低劑量組（TL）、七味白術散總苷中劑量組（TM）、七味白術散總苷高劑量組（TH），每組各5只。治療期間正常組及自然恢復組小鼠灌胃無菌水，其余各組分別給予七味白術散水煎液及低、中、高劑量七味白術散總苷。根據臨床等效劑量換算，七味白術散水煎液的給藥劑量為9.945 g/kg/d，七味白術散水煎液給藥劑量乘以提取率的1、2、4倍量分別為七味白術散總苷低（147.2 mg/kg/d）、中（294.4 mg/kg/d）、高劑量（588.8 mg/kg/d），灌胃量為 0.4 mL/只/次，每天2次，連續給藥3 d。

1.2.6 檢測指標

1.2.6.1 攝食量、體重及臟器指數測定 觀察小鼠糞便及一般行為狀態，分不同階段記錄小鼠的攝食量。分別在小鼠購回當天、適應期結束、造模期結束、治療期結束稱取每只小鼠的體重，在小鼠處死解剖后取出脾臟、胸腺及肝臟，濾紙吸干血液后稱重，計算脾臟指數、胸腺指數及肝臟指數等臟器指數。臟器指數（%）= 臟器重量（g）/小鼠體重（g）×100%。

1.2.6.2 腸道微生物培養 治療結束后頸椎脫臼處死小鼠，無菌環境下收集小鼠腸道內容物，同組樣品混勻后放入裝有無菌水及玻璃珠的錐形瓶中，120 r/min震蕩30 min后涂布平板后培養計數。細菌總數用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，大腸桿菌用伊紅美藍瓊脂（Eosin methylene blue，EMB）培養基，雙歧桿菌用BBL瓊脂培養基；乳酸菌用MRS瓊脂培養基。采用混菌法計數，每個稀釋度做3次重復，計算每克腸道內容物所含的菌數［9］。

1.2.6.3 腸道微生物活度測定 取材方法同1.3.2。吸取2.5 mL FDA儲備液加入pH 7.6已滅菌的磷酸緩沖液中（A液），取干燥無菌試管，加入2 mL A液、50 μL待測液置于24℃搖床反應90 min后加2 mL丙酮終止反應。空白對照為2 mL A液中依次加入50 μL待測液及2 mL丙酮，24℃搖床反應90 min取出。在490 nm下測定吸光值，每個樣品平行測定3次，以A490值表示單位質量樣品的微生物活度［17］。

1.2.6.4 腸道酶活性測定 取材方法同1.3.2。將各組小鼠腸道內容物樣品分別放入裝有無菌水及玻璃珠的離心管中，震蕩2 min后3 000 r/min離心10 min，取上清液。乳糖酶活性測定用ONPG法，蔗糖酶活性測定用DNS比色法［10-11］。

1.2.7 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行統計學分析，結果用平均值 ± 標準差（±s）表示。用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠糞便及攝食量的影響

正常組小鼠的糞便為黑色，圓柱狀，按壓后不黏手。混合抗生素灌胃后小鼠排便次數明顯增多，糞便為黃色、稀濕、松軟，按壓后黏手，能看見未完全消化的食物。經治療后七味白術散水煎液組小鼠的糞便逐漸好轉，治療3 d后接近正常糞便。不同劑量七味白術散總苷組的小鼠糞便由黃轉黑，但糞便仍較稀濕。各組小鼠的精神狀態在造模及治療期間無明顯差異。混合抗生素使小鼠的攝食量減少，而七味白術散水煎液及不同劑量的七味白術散總苷可使菌群失調腹瀉小鼠的攝食量恢復（圖1）。

圖1 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠攝食量的影響Fig. 1 Effects of total glycosides of QWBZP on the food intake of mice with dysbacteria-diarrhea

2.2 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠體重的影響

體重是評價機體生長發育與健康情況的直觀指標。從表1可知各組小鼠的初始體重及適應期增重率較接近，造模期間混合抗生素使小鼠的增重率降低，但與正常組相比無顯著差異，說明混合抗生素抑制了小鼠體重增長。在治療期間，自然恢復組小鼠的增重率高于正常組，差異極顯著（P＜0.01），其余各組小鼠的增重率與正常組相比提高，但無顯著差異，說明七味白術散水煎液及總苷有利于體重的恢復。

表1 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠體重的影響Table 1 Effects of total glycosides of QWBZP on the body weight of mice with dysbacteria-diarrhea（n = 5）

2.3 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠臟器指數的影響

與正常組相比，其他各組小鼠的脾臟指數有不同程度的提高，且高劑量組小鼠的脾臟指數與正常組小鼠差異顯著（P＜0.01）。經過3 d治療，水煎液組及中劑量總苷組小鼠的脾臟指數逐漸回到正常水平。與自然恢復組相比，低、高劑量的七味白術散總苷組小鼠的脾臟指數增加，中劑量的七味白術散總苷組小鼠的脾臟指數降低，但差異不顯著。各組小鼠的胸腺指數及肝臟指數均無顯著差異（表2）。

表2 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠臟器指數的影響Table 2 Effects of total glycosides of QWBZP on the visceral index of mice with dysbacteria-diarrhea（n = 5）

2.4 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道微生物的影響

從表3可知，混合抗生素增加了小鼠腸道細菌（P＜0.01）及大腸桿菌（P＜0.05）的數量，降低了雙歧桿菌及乳酸菌的數量（P＜0.05）。七味白術散水煎液顯著降低了菌群失調腹瀉小鼠腸道中細菌及大腸桿菌的數量（P＜0.05），同時提高了雙歧桿菌及乳酸菌的數量，但無顯著差異。低劑量的七味白術散總苷提高了菌群失調腹瀉小鼠大腸桿菌（P＜0.01）、雙歧桿菌（P＜0.01）及乳酸菌（P＜0.05）的數量，降低了細菌的數量（P＜0.01）；中劑量的七味白術散總苷提高了菌群失調腹瀉小鼠細菌、大腸桿菌及乳酸菌的數量，差異極顯著（P＜0.01）；高劑量的七味白術散總苷顯著提高了菌群失調腹瀉小鼠大腸桿菌（P＜0.05）及乳酸菌（P＜0.01）的數量。總體而言，不同劑量的七味白術散總苷均提高了菌群失調腹瀉小鼠大腸桿菌、雙歧桿菌及乳酸菌的數量，但作用強度不一，低劑量七味白術散總苷對雙歧桿菌及乳酸菌的增殖效果顯著。

表3 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道微生物的影響Table 3 Effects of total glycosides of QWBZP on the intestinal microbiota of mice with dysbacteria-diarrhea（n = 3）

2.5 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道微生物活度的影響

從圖2可知，混合抗生素使小鼠腸道微生物活度極顯著下降，經3 d的自然恢復仍未回到正常水平（P＜0.01）。七味白術散水煎液及不同劑量的七味白術散總苷均可提高菌群失調腹瀉小鼠的腸道微生物活度（P＜0.01或P＜0.05）。經過3 d的治療，低劑量組小鼠的腸道微生物活度與正常組接近。總體而言，不同劑量的七味白術散總苷可提高菌群失調腹瀉小鼠的腸道微生物活度，且表現出一定的劑量效應。

圖2 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道微生物活度的影響Fig. 2 Effects of total glycosides of QWBZP on the intestinal microbial activities of mice with dysbacteriadiarrhea（n=3）

2.6 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道乳糖酶活性的影響

與正常組相比，混合抗生素大大降低了小鼠腸道乳糖酶的活性（P＜0.01）。經過3 d的治療，七味白術散水煎液及總苷極顯著提高了菌群失調腹瀉小鼠腸道乳糖酶活性（P＜0.01），且高于正常組（P＜0.01）。七味白術散總苷對乳糖酶活性的影響表現出一定的劑量效應（圖3）。

圖3 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道乳糖酶活性的影響Fig. 3 Effects of total glycosides of QWBZP on the lactase activities of mice with dysbacteria-diarrhea（n=3）

2.7 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道蔗糖酶活性的影響

抗生素及七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道蔗糖酶活性的影響與乳糖酶相似，混合抗生素顯著降低了小鼠腸道蔗糖酶的活性（P＜0.05），七味白術散水煎液及總苷均提高了菌群失調腹瀉小鼠腸道蔗糖酶活性（P＜0.01或P＜0.05）。低、中劑量的七味白術散總苷對蔗糖酶的作用強度與七味白術散水煎液接近，而高劑量的七味白術散總苷使蔗糖酶活性更趨于正常組（圖4）。

圖4 七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道蔗糖酶活性的影響Fig.4 Effects of total glycosides of QWBZP on the sucrase activities of mice with dysbacteria-diarrhea（n=3）

3 討論

在正常狀態下，機體的腸道微生物保持著動態平衡，共同參與機體的代謝及免疫。腸道微生態失衡是疾病的主要觸發因素，中藥復方可將腸道微生態從病理狀態調至生理狀態而發揮療效。課題組前期的研究顯示了七味白術散通過對腸道微生物的促抑作用使腸道微生態恢復平衡而治療菌群失調腹瀉，但其調節腸道微生態的物質基礎尚不明確。本研究以七味白術散水煎液為參照，探討了七味白術散總苷成分對腸道微生態的調節作用。通過傳統的微生物培養技術發現七味白術散總苷可促進菌群失調腹瀉小鼠腸道中雙歧桿菌及乳酸菌增殖，且效果優于七味白術散水煎液。同時，七味白術散總苷還提高了菌群失調腹瀉小鼠腸道中大腸桿菌的數量，與七味白術散水煎液的作用趨勢相反。雙歧桿菌與乳酸菌被認為是有益菌，二者可通過抑制致病菌感染，改善腸黏膜屏障，抑制促炎因子產生，改變樹突細胞功能等途徑調節腸道穩態［18］。大腸桿菌為條件性致病菌，與腹瀉、炎癥有關［9］。結果表明苷類成分是七味白術散復方調節雙歧桿菌及乳酸菌的主要成分，低劑量的七味白術散總苷可更好促進有益菌的增殖，而總苷類成分促進大腸桿菌的增殖可能是其改善糞便含水量方面不及七味白術散水煎液的原因。然而，腸道環境中微生物的變化十分復雜，體外培養僅能反映腸道微生物變化的冰山一角，仍需利用高通量測序技術進一步研究七味白術散總苷對菌群失調腹瀉小鼠腸道微生態的影響。

FDA可被存在于細菌及真菌中的酯酶、蛋白酶、脂肪酶等非專一性酶催化水解產生熒光素，且FDA水解酶活性與微生物活性成正比［19］。以往研究多用于評價土壤微生物活性及土壤質量。考慮到腸道菌群亦可分泌大量的水解酶，從而實現FDA的高效水解，而水解是腸道微生物代謝食物和藥物的主要途徑，FDA水解酶活性在一定程度可反映腸道微生物的代謝能力，因此本課題組將FDA水解法應用腸道微生物，以反映腸道微生物活性及功能的變化［17，20］。研究結果顯示不同處理對小鼠腸道微生物活度、乳糖酶及蔗糖酶活性的影響高度一致，可進一步證明用FDA水解法評價動物或人體腸道微生物活度及功能具有可靠性。在本研究中，七味白術散水煎液及總苷都可提高菌群失調腹瀉小鼠腸道的微生物活度，且不同劑量的七味白術散總苷表現出一定的劑量效應，低劑量的七味白術散總苷對腸道微生物活度的影響與水煎液相當，接近正常水平。提高菌群失調腹瀉小鼠的腸道微生物活度，增強腸道微生物的代謝能力，是七味白術散減輕腹瀉的機制之一。苷類化合物的極性大，生物利用度低，大多需要進入腸道后被糖苷水解酶水解為次級苷或苷元才發揮藥效［4］。因此，腸道微生物活度及水解酶活性的提高，也有利于七味白術散總苷的代謝，釋放出真正的藥效成分。結合七味白術散總苷在菌群失調小鼠體內的轉化情況，建立藥物與腸道微生物的互作網絡，將更有利于闡述七味白術散治療菌群失調腹瀉的機制。

乳糖酶及蔗糖酶是存在于小腸壁刷狀邊緣的雙糖酶，可將膳食中的雙糖分解為單糖，與腹瀉密切相關。如乳糖酶及蔗糖酶缺乏會導致過量的碳水化合物在小腸堆積，增加腸道滲透負荷，導致腸腔液增加，引發滲透性腹瀉。而過量的發酵產物使得腸內氣壓增高，小腸膨脹導致腹脹和腹痛［21］。研究還發現雙糖酶水平與炎癥呈負相關，因此雙糖酶缺乏還多與炎癥性腸病、腹腔疾病、淋巴細胞性結腸炎等胃腸道疾病共存［22］。課題組前期發現七味白術散治療菌群失調腹瀉與乳糖酶及蔗糖酶活性的提高有關。本研究發現不同劑量的七味白術散總苷均可使菌群失調腹瀉小鼠腸道乳糖酶及蔗糖酶活性提高，與全方對菌群失調腹瀉小鼠腸道乳糖酶及蔗糖酶活性的影響趨勢一致，苷類成分是七味白術散調節腸道微生態、治療菌群失調腹瀉的重要藥效成分。

4 結論

七味白術散總苷可促進雙歧桿菌及乳酸菌的增殖，提高腸道微生物活度及乳糖酶、蔗糖酶的活性，作用趨勢與七味白術散水煎液一致，但程度有異。腸道微生態為揭示苷類成分在七味白術散治療菌群失調腹瀉中的作用提供了有力證據，可作為評價中藥復方有效物質的切入點之一。