侵染廣西紅寶石青柚的柑橘褪綠矮化相關病毒遺傳進化分析

李戰彪 劉麗輝 崔麗賢 陳錦清 朱英芝 李霽軒 謝慧婷 秦碧霞 蔡健和

摘要：【目的】明確引起廣西多地泰國紅寶石青柚產生葉片變形、扭曲、皺縮、褪綠花葉和矮化癥狀的病原，為有效防治該病害提供理論依據。【方法】從廣西多地采集疑似發病的紅寶石青柚葉片樣品，利用柑橘褪綠矮化相關病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV）特異引物進行PCR檢測，通過分段擴增、克隆等方法對樣品進行鑒定并獲取全長基因序列，運用RDP5和MEGA 7.0對所獲得的全長基因序列進行重組及遺傳多樣性分析?！窘Y果】PCR檢測結果顯示采集的紅寶石青柚葉片樣品可擴增出642 bp的目的條帶，證實紅寶石青柚受到CCDaV感染;采用分段克隆的方法獲得LA-1、LA-2、WM-1、GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2等7個各地代表分離物的全長序列，序列長度分別為3641、3642、3642、3640、3642、3644和3644 bp;核苷酸相似性比對發現，7個分離物間的核苷酸相似性在98%以上，與GenBank已登錄的CCDaV各分離物間的核苷酸相似性在99%以上，說明研究獲得的病毒分離物為CCDaV的分離物;重組分析發現，7個分離物未發生重組。系統發育進化樹分析結果顯示，研究獲得的WZ-1和WZ-2分離物分別與Tha1-19、Tha30處于同一個小分支，說明這2個分離物與Tha1-19和Tha30具有較近的親緣關系;其余幾個分離物則分處不同的小分支，說明CCDaV廣西分離物間仍有一定的進化多樣性。【結論】引起廣西紅寶石青柚葉片呈V字型、皺縮、卷曲、褪綠花葉和植株嚴重矮化等癥狀的病原為CCDaV，部分地區分離物存在地域多樣性。

關鍵詞： 柑橘褪綠矮化相關病毒;紅寶石青柚;遺傳進化;廣西

中圖分類號： S432.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2758-07

Abstract：【Objective】To clarify the pathogen of the Ruby green pomelo showing symptoms of leaf deformation， curling， shrinking，chlorotic and dwarfing， and provide a theoretical basis for effective prevention and treatment of the disease.【Method】 Several leaf samples were collected from suspected Ruby green pomelo in some cities of Guangxi， and two pairs of specific primers of Citrus chlorotic dwarf-associated virus（CCDaV） were designed and used for detected the suspected samples， the full-length of genome sequence were obtained by segmented amplification and gene cloning. RDP5 and MEGA 7.0 softwares were applied for analyze the recombination and the genetic diversity of the full length genome. 【Result】PCR with expected size of 642 bp were obtained from all of the collected Ruby green pomelo samples， which confirmed that all of the samples were infected by CCDaV. The full-length genome sequences of seven locations representing isolates LA-1， LA-2， WM-1， GG-1， GG-2， WZ-1 and WZ-2 were obtained by using segmented amplification and gene cloning， and the full-length sequences of the seven isolates were 3641， 3642， 3642，3640， 3642， 3644 and 3644 bp， respectively. The nucleotide sequence identities between the seven isolates were over 98%， and the identities against other CCDaV isolates available in GenBank were over 99%， this results showed that the seven isolates obtained in this research were CCDaV isolates. Recombination analysis showed that no recombination occurred in the seven isolates. Phylogenetic analysis showed that two CCDaV Guangxi isolates（WZ-1 and WZ-2） clustered with Tha1-19 and Tha30 in a sub-clade， indicating their close relation. The other isolates of Guangxi were distributed in different sub-clade， indicating that there were evolutionary diversity among the CCDaV Guangxi isolates. 【Conclusion】 CCDaV is the pathogen that infects the Ruby green pomeloshowing symptoms of V shape， shrinking， curling， chlorotic and dwarfing， and there is regional diversity of the isolates among different regions.

Key words：Citrus chlorotic dwarf-associated virus; Ruby green pomelo; genetic and evolutionary; Guangxi

Foundation item：Guangxi Innovation Driven Development Special Fund Project（GuikeAA18118046-1，GuikeAA18 118046-5）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT071）

0 引言

【研究意義】近年來，我國柑橘產業發展迅猛，特別是在廣西，柑橘產業已成為帶動地區脫貧、農村就業的支柱產業。但柑橘產業快速發展也帶來了諸多問題，病蟲害的區域間發生流行已成為不可忽視的問題。隨著柑橘種植面積不斷擴大和新品種引進種植，區域間種苗調運頻繁，由于難于監管，導致多種病蟲害通過種苗攜帶傳播流行，并造成嚴重危害，其中，病毒病害尤其突出。本研究團隊2019年發現新引種的紅寶石青柚上發生一種疑似新的病毒病害，對廣西柑橘產業存在潛在威脅，而明確該病害的病原可為該病害流行規律及防控技術研究提供指導?！厩叭搜芯窟M展】柑橘病毒病是一類嚴重影響柑橘產量及質量的重要病害。目前世界上已報道的柑橘病毒及類病毒有30余種（吳佳星，2020）;在我國，柑橘生產上主要的病毒有11種：柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）、柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）、溫州蜜柑萎縮病毒（Satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘黃脈病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、柑橘褪綠矮化相關病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV）、柑橘葉斑駁病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）、柑橘樹皮裂紋類病毒（Citrus bark cracking viroid，CBCVd）、柑橘鱗皮病毒（Citrus psorosis virus，CPsV）、柑橘類病毒V（Citrus viroid V，CVdV）和柑橘類病毒VI（Citrus viroid V，CVdVI）（張艷慧等，2017）。其中，柑橘褪綠矮縮病是近年來新發生的柑橘病毒性病害，其病原是柑橘褪綠矮化相關病毒（Korkmaz et al.，1995; Kersting et al.，1996; Loconsole et al.，2012）。CCDaV基因組為單鏈DNA，屬于雙生病毒科（Geminiviridae），主要通過嫁接、刀割和楊梅粉虱（Parabemisia myricae Kuwana）進行傳播;該病毒可侵染大多數的柑橘類作物，早期癥狀出現在春季的嫩葉上，主要癥狀特征包括葉片呈現V字型，同時伴隨有葉片變形、扭曲、花葉和節間變短等癥狀，嚴重影響柑橘產量和質量（Korkmaz et al.，1995; Richard et al.，2008; Loconsole et al.，2012）。20世紀80年代末期，該病害最早發生于土耳其的地中海區域，給土耳其柑橘產業造成極大危害，特別是葡萄柚，產量損失超過50%以上（Korkmaz et al.，1995; Kersting et al.，1996; Loconsole et al.，2012）。2008年，在我國云南瑞麗一個酸橙果園上首次發現該病害，但發病率較低，未引起廣泛關注（Guo et al.，2015）。2017年，Zhou等對該病在我國的分布進行調查，結果發現CCDaV仍只發生在我國的云南省。2020年，Yang等在泰國也發現并報道了該病。前人的研究結果證實，柑橘褪綠矮化病正在向全世界的柑橘產區擴散蔓延，應引起重視。【本研究切入點】近年來，廣西柑橘產業發展迅猛，新品種泰國紅寶石青柚在廣西得到迅速推廣種植。2019—2020年，本研究團隊在廣西南寧、貴港等多地柑橘育苗場和果場走訪、調查，發現泰國紅寶石青柚存在葉片變形、扭曲皺縮、褪綠花葉和矮化等疑似CCDaV病毒感染癥狀，發病率高達10%～15%，但引發該類癥狀的病原尚未明確。【擬解決的關鍵問題】利用分子生物學手段對疑似柑橘褪綠矮縮病病樣進行檢測、鑒定，明確引發該類癥狀的病害病原，并通過分段克隆的方法獲取相關病毒病原的全序列基因組，運用RDP和MEGA等軟件分析該病毒病原的來源和進化規律，為紅寶石青柚上柑橘褪綠矮縮病的防控打下理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2019年11月—2020年11月，分別從廣西梧州市藤縣太平鎮（東經23°39′14″，北緯110°42′37″）（6個葉片樣品）、南寧市隆安縣那桐鎮浪灣農場（東經23°05′06″，北緯107°54′19″）（10個葉片樣品）、貴港市覃塘區大嶺鎮（東經22°53′38"，北緯109°32′45″）（4個葉片樣品）和港南區木格鎮（東經22°47′45″，北緯109°44′）（5個葉片樣品）、南寧市武鳴區府城鎮（東經23°15′06″，北緯108°07′57″）（10個葉片樣品）和太平鎮（東經23°08′02″，北緯108°22′34″（6個葉片樣品）等地采集疑似感染CCDaV的紅寶石青柚葉片樣品，葉片樣品保存于-20 ℃備用。

1. 2 DNA提取

取柚子葉片樣品100 mg，用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取葉片總DNA。具體操作按照試劑盒說明書進行。最后將DNA沉淀溶解于50 μL ddH2O中， -20 ℃保存備用。

1. 3 PCR檢測

參考NCBI中已登錄的CCDaV全基因序列（登錄號NC_018151、MN509442.1、MG566055.1和KX840470.1等），設計可擴增CCDaV部分基因序列的特異PCR引物，CCDaV-F：5'-GGACAATATGGG ACAAGCCGTG-3'/CCDaV-R：5'-GGATCGTATGG GCCACAGACC-3'，目的條帶大小約為642 bp;以健康柚子葉片總DNA為陰性對照進行PCR擴增。反應體系20.0 μL：總DNA 1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×Taq Master Mix （Dye）（康為世紀生物科技有限公司）10.0 μL，ddH2O 8.0 μL。菌落PCR反應體系10.0 μL：10 μmol/L上、下游引物CCDaV-F/CCDaV-1047R（CCDaV-1047R：5'-AACACAAATC TAACGGCCTCAGG-3'）或CCDaV-1047F（CCDaV-1047F：5'-CAGTGCGTGGTCGTTGTAGTCG-3'）/CCDaV-R各0.5 μL，2×Taq Master Mix （Dye）（康為世紀生物科技有限公司）5.0 μL，ddH2O 4.0 μL，滅菌牙簽挑取菌落作為模板溶解于PCR反應體系中。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s或72 ℃ 3 min，進行35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1. 4 全基因序列擴增

以PCR檢測為陽性的柚子葉片總DNA為模板，利用CCDaV-F/CCDaV-1047R或CCDaV-1047F/CC DaV-R分段擴增CCDaV各分離物的全基因序列，反應體系20.0 μL：總DNA 1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10.0 μL，ddH2O 8.0 μL。所得PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行切膠純化。

1. 5 基因克隆及序列分析

利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）回收PCR產物，將經回收純化的PCR產物連接至pEASY-Blunt Cloning Kit（北京全式金生物技術有限公司）中的克隆載體上;連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，采用菌落PCR的方法篩選3個陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。所得序列經Vector NTI 11.0進行拼接后，使用NCBI的ORF Finder程序進行開放讀碼框（Open reading frames，ORF）預測;利用MEGA 7.0的最大似然法（Maximum likelihood，ML）構建系統發育進化樹，步值設置為1000;利用RDP5中的RDP、GENECONV、Chimaera和MaxChi進行重組分析。

2 結果與分析

2. 1 泰國紅寶石青柚病樣癥狀及PCR檢測結果

2019—2020年，本課題組在廣西南寧、貴港等多地柑橘育苗場和果場走訪、調查，發現泰國紅寶石青柚的葉片呈V字型、皺縮、卷曲、褪綠花葉、植株嚴重矮化等，疑似CCDaV病毒感染癥狀（圖1），發病率高達10%～15%。采集疑似病毒感染的柚子葉片樣品，利用柑橘褪綠矮化相關病毒特異引物CCDaV-F/CCDaV-R對青柚葉片總DNA進行PCR檢測，結果發現，廣西梧州市藤縣（6個葉片樣品）、南寧市隆安縣（10個葉片樣品）、貴港市（8個葉片樣品）、南寧市武鳴區府城鎮（10個葉片樣品）和太平鎮（4個葉片樣品）等地的柚子葉片樣品均可擴增出642 bp的目的條帶（部分檢測結果見圖2），而健康柚子葉片對照則無相應擴增;將PCR產物回收純化后直接測序，所得序列在NCBI中進行BLASTn分析，結果發現本研究所得序列與NCBI已報道的CCDaV各分離物序列核苷酸相似性均在99%以上，說明所采集的青柚葉片感染了CCDaV病毒。

2. 2 病毒分離物基因組全序列克隆及分析結果

前期嘗試利用RCA試劑盒擴增病毒的全序列，但常用的內切酶進行酶切后電泳均得不到目的片段為3.6 kb的電泳條帶，遂采用分段擴增的方法對所采集的柚子葉片總DNA進行擴增，以期能獲得CCDaV各分離物的全基因序列。挑選7個有代表性的柚子DNA利用CCDaV-F/CCDaV-1047R和CCDaV-1047F/CCDaV-R兩對引物組合進行擴增，產物經電泳、回收純化后連接至pEASY-Blunt Cloning Kit中的克隆載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆子進行序列測定。所得序列經拼接比對后發現，共獲得LA-1、LA-2、WM-1、GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2等7個各地代表分離物的全長序列分別為3641、3642、3642、3640、3642、3644和3644 bp（GenBank登錄號分別為：MW413549、MW413550、MW413551、MW413552、MW413553、MW413554和MW413555），兩兩序列間的核苷酸相似性均在98%以上，可認定為同一病毒的不同分離物。

進一步分析7個分離物的分子特征，發現7個分離物中的3個分離物（LA-1、LA-2和WM-1）編碼5個ORF，而其余4個分離物則編碼4個ORF。其中LA-1、LA-2、WM-1、GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2等7個分離物正鏈均編碼V2蛋白[運動蛋白（Movement protein，MP），LA-1：195～614 nt、LA-2：195～614 nt、WM-1：194～613 nt、GG-1：195～614 nt、GG-2：195～614 nt、WZ-1：195～614 nt和WZ-2：197～616 nt]、V1蛋白[外殼蛋白（Coat protein，CP），LA-1：418～1182 nt、LA-2：418～1182 nt、WM-1：417～1181 nt、GG-1：418～1182 nt、GG-2：418～1182 nt、WZ-1：418～1182 nt和WZ-2：420～1184 nt]和V3蛋白（運動蛋白，LA-1：1212～2132 nt、LA-2：1213～2133 nt、WM-1：1213～2133 nt、GG-1：1213～2133 nt、GG-2：1213～2133 nt、WZ-1：1214～2134 nt和WZ-2：1215～2135 nt），互補鏈均編碼類Rep蛋白[（RepA-like protein），LA-1：2612～3421 nt、LA-2：2613～3422 nt、WM-1：2613～3422 nt、GG-1：2611～3420 nt、GG-2：2613～3422 nt、WZ-1：2614～3423 nt和WZ-2：2615～3424 nt];LA-1、LA-2和WM-1的互補鏈編碼1個類C1：C2蛋白[（C1：C2 like protein），LA-1：2301～2708 nt、LA-2：2302～2709 nt、WM-1：2302～2709 nt]，而GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2在其相應編碼區域存在多個終止密碼子，無法形成完整的ORF。

將本研究獲得的基因序列利用NCBI中BLASTn工具與GenBank已報道的病毒序列進行比對分析，發現廣西的7個分離物與GenBank中已報道的各CCDaV分離物序列具有較高的核苷酸相似性。進一步利用SDT軟件進行比對分析，發現廣西分離物的核苷酸序列與用于分析的各CCDaV分離物的核苷酸相似性均在99%以上（圖3）。

2. 3 CCDaV廣西分離物的重組及進化分析結果

為分析CCDaV是否存在重組，挑選TK4和CN001作為參考基因序列利用RDP5中的RDP、GENECONV、Chimaera和MaxChi進行重組分析，結果發現CCDaV尚未有重組事件發生。

為分析CCDaV廣西分離物與已報道的CCDaV各分離物的親緣關系，利用MEGA 7.0將廣西分離物與12個CCDaV分離物構建系統發育進化樹，最大似然法構建的進化樹為最優樹（圖4）。從圖中可看出，廣西各分離物處于不同的分支，其中WZ-2與泰國分離物Tha30處于同一分支，說明其與Tha30親緣關系較近;WZ-1、GG-1、GG-2和Tha1-19同處于一個大分支，說明與Tha1-19親緣關系較近，而WZ-1與泰國分離物Tha1-19又處于一個小分支，說明WZ-1與Tha1-19的親緣關系更近;LA-2與WM-1處于同一分支，說明二者間親緣關系較近;而LA-1則獨立處于一個小分支，進化來源可能與其他分離物存在差異，說明CCDaV廣西分離物間仍有一定的進化多樣性。

3 討論

柑橘褪綠矮縮病是一種危險性柑橘病毒病害，已給土耳其柑橘產業帶來極大危害，且可能對全世界柑橘產業產生潛在威脅（Kersting et al.，1996; Richard et al.，2008）。在我國，該病害最早于2008年在云南瑞麗被發現并報道，但多年間并未擴展蔓延。本研究利用分子生物學技術獲得侵染廣西紅寶石青柚的病毒基因組序列，通過分析其分子特征及進化關系，發現廣西分離物具有CCDaV病毒基因組的典型分子特征，且與其他已報道的CCDaV分離物的核苷酸相似性均在99%以上，可認定為CCDaV的分離物（Loconsole et al.，2012）。研究也發現，廣西分離物進化較保守，且存在一定的地域分布特征，與Karanfil和Korkmaz（2019）、Yang等（2020）的研究結果一致。調查發現廣西區內的紅寶石青柚均為泰國引種，而廣西分離物呈現的地域分布特征可能與引種地不同相關，具體原因有待進一步探究。

Loconsole等（2012）通過小RNA測序證實CCDaV是單鏈DNA病毒，并且認為其編碼5個ORF。而本研究中GG-1和GG-2在2302～2708 nt，WZ-1、WZ-2在2303～2709 nt和2304～2710 nt區域則存在多個終止密碼子，無法形成完整的ORF。通過將上述序列與GenBank已登錄的相應序列進行比對分析，發現這些序列在該區域的相似性高達99%以上（數據未顯示），且均存在多個終止密碼子，因此，該區域是否編碼完整的ORF仍有待進一步證實。如果該區域無法完整編碼ORF，那么CCDaV是否仍然是雙生病毒科成員也是一個需要探討的科學問題，仍需進一步研究證實。

柑橘褪綠矮縮病是一種較新的柑橘病毒病害，各方面研究仍不完善，前人研究表明該病可借助嫁接、刀割以及楊梅粉虱通過半持久或持久方式進行傳播（Korkmaz et al.，1995），但Zhou等（2017）、Karanfil和Korkmaz（2019）分別就CCDaV在我國及土耳其的分布進行調查，發現該病害并未廣泛傳播;不同的是，楊梅粉虱在云南的種群較龐大，而在土耳其的種群較小，但無論種群大小，該病的傳播流行并未呈現明顯差別（劉曼等，2010;Zhou et al.，2017;Karanfil and Korkmaz，2019）。同時，Zhou等（2017）采集云南的楊梅粉虱進行分子鑒定，發現楊梅粉虱體內并未攜帶CCDaV，因此，楊梅粉虱是否能夠傳播CCDaV，其傳播CCDaV的效率仍有待進一步研究，而是否存在其他潛在的傳播介體也需要進一步研究證實。在我國江西、廣東、浙江、四川和上海等地的柑橘產區均有楊梅粉虱分布（王向東和羅林軍，2007;王炎，2007;沈穎等，2017;閆鳳鳴和白潤娥，2017），廣西尚未有楊梅粉虱的相關報道;根據前期調查研究及分析推測，該病極有可能通過泰國紅寶石青柚帶病苗木在廣西等地擴散蔓延，而廣西是否存在楊梅粉虱、CCDaV是否會通過楊梅粉虱傳播危害其他柚類等柑橘品種、是否存在其他潛在的傳播介體幫助CCDaV在廣西傳播流行、是否對柑橘產業造成嚴重經濟損失等問題都值得進一步關注及監測研究。

柑橘褪綠矮縮病危害較大，可侵染多數的柑橘類作物，僅甜橙具有一定抗性（Korkmaz et al.，1995），給柑橘產業帶來極大的潛在威脅，因此，針對目前該病的防控，建議抓好如下幾點：（1）嚴格苗木檢測，培育健康苗木，嚴禁帶病種苗出圃;（2）加強苗木調運檢疫監管，防止帶病苗木調運;（3）及時防治傳播介體楊梅粉虱，切斷傳播途徑。

4 結論

侵染廣西紅寶石青柚引起葉片呈V字型、皺縮、卷曲、褪綠花葉和植株嚴重矮化等癥狀的病原為柑橘褪綠矮化相關病毒;通過分析部分分離物的全基因序列，發現CCDaV廣西分離物進化相對保守，但仍存在一定的地域多樣性。

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（責任編輯 麻小燕）