迪慶藏豬ADFP基因多態性及其組織表達特征

相德才 張斌 韓敏 劉韶娜 趙智勇 吳國權

摘要：【目的】從分子遺傳學角度分析不同基因型迪慶藏豬群體不同組織中ADFP基因的表達差異，為迪慶藏豬的選育工作提供參考依據。【方法】利用PCR擴增測序方法對113頭迪慶藏豬ADFP基因進行擴增測序，利用DNASTAR 5.0對序列進行比對分析及多態性位點（SNPs）檢測;同時利用實時熒光定量PCR方法對迪慶藏豬不同組織中ADFP基因相對表達量進行檢測，并運用SPSS 20.0分析ADFP基因多態性對迪慶藏豬群體不同組織中ADFP基因表達水平的影響。【結果】在迪慶藏豬ADFP基因外顯子6上發現3個SNPs，分別為SNP1（C→T）、SNP2（C→T）和SNP3（T→C），其中SNP1和SNP2位點屬于低度多態（PIC/He<0.25），SNP3位點屬于中度多態（0.25<PIC/He<0.5）。迪慶藏豬不同組織中ADFP基因相對表達量存在顯著差異（P<0.05，下同），皮下脂肪中相對表達量最高，其次為肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腿肌和背肌，心臟中相對表達量最少;另外，ADFP基因SNPs不同基因型迪慶藏豬群體中各組織的相對表達量也存在顯著差異，尤其在SNP2位點雜合基因型群體腎臟中相對表達量顯著高于純合基因型群體腎臟中相對表達量，表明ADFP基因SNPs變異對迪慶藏豬組織中ADFP基因表達具有影響。【結論】ADFP基因SNPs變異對迪慶藏豬組織中ADFP基因會產生差異表達，進而影響機體脂肪沉積，ADFP基因可作為迪慶藏豬肌內脂肪沉積的候選基因。

關鍵詞：迪慶藏豬;ADFP基因;多態性;脂肪沉積

中圖分類號：S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2872-08

Abstract：【Objective】This study aimed to analyze the expression difference of ADFP gene in different tissues of Diqing Tibetan pig with different genotypes from the perspective of molecular genetics， so as to provide a reference for breeding of Diqing Tibetan pig. 【Method】In this study， the ADFP gene of 113 Diqing Tibetan pigs were amplified using PCR and sequenced， and the sequence alignment and the polymorphic sites（SNPs） were detected with DNASTAR 5.0. Meanwhile， the real-time fluorescence quantitative PCR（qPCR） was used to detect the relative expression of the ADFP gene in tissues of Diqing Tibetan pigs， and the SPSS 20.0 was used to analyze the effect of ADFP gene polymorphism on its expression in the tissues of Diqing Tibetan pigs. 【Result】Three SNP1（C→T）， SNP2（C→T） and SNP3（T→C） were found on exon 6 of ADFP gene in Diqing Tibetan pig， and SNP1 and SNP2 were low polymorphic（PIC/He<0.25） and SNP3 was moderate polymorphic（0.25<PIC/He<0.5）. There were significant differences in the relative expression levels of ADFP gene in different tissues of Diqing Tibetan pigs（P<0.05， the same below）. Subcutaneous fat had the highest relative expression level， followed by lung， liver， spleen， kidney， leg muscle and back muscle， heart had the lowest expression level. In addition， there were also significant differences in the relative expression levels of ADFP gene polymorphisms among different genotypes in the Diqing Tibetan pig. Especially， the relative expression of the gene in the heterozygous genotype groups at SNP2 was significantly higher than that in the homozygous genotype groups， the results showed that the polymorphisms of ADFP gene had an effect on the expression of ADFP gene in tissues of Diqing Tibetan pig. 【Conclusion】The difference of ADFP gene polymorphism sites can cause differential expression of ADFP gene in tissues of Diqing Tibetan pig， and then affect fat deposition in the body， ADFP gene can be used as a candidate gene for fat deposition in Diqing Tibetan pig。

Key words： Diqing Tibentan pig;ADFP gene;polymorphism;fat deposition

Foundation item：Major Science and Technology Project of Yunnan （202102AE090039）;Yunnan Applied Basic Research Project（2017FD055，2018FD001）;Yunnan Animal Science and Veterinary Institute Applied Basic Research Project（2019RW008）

0 引言

【研究意義】脂肪沉積受肌肉中脂肪細胞數量或脂肪細胞沉積速度的影響，其中，脂肪分化相關蛋白（Adipose differentiation-related protein，ADFP）可能是脂肪沉積性狀的候選基因（Desruisseaux et al.，2007）。豬ADFP基因由8個外顯子組成，全長約13 kb，位于1號染色體q2.3～q2.7上、微衛星標記SW2185和SW974之間（Nie et al.，2005）。豬ADFP基因cDNA（1848 bp）含有一個1377 bp的開放閱讀框，編碼一個由459個氨基酸組成的蛋白（Kim et al.，2005）。脂肪分化相關蛋白（ADFP）覆蓋在磷脂蛋白脂滴表面，其參與巨噬細胞的脂質代謝（Wang et al. 1999），可上調脂肪酸的生成（Imamura et al.，2002），同時參與脂質轉移（Schultz et al.，2002），促進脂滴的形成并儲存脂肪酸（Listenberger et al.，2007）。因此，研究與肌內脂肪沉積相關的候選基因及其分子機制已成為合理提高肌內脂肪含量的重要方向。【前人研究進展】ADFP基因的遺傳變異可能與背脂厚度（BF）和肌內脂肪（IMF）性狀的表型變異有關（Imamura et al.，2002），奶山羊ADFP基因過表達也會顯著促進乳腺上皮細胞中的脂質積累（余康，2014）;ADFP基因在地方雞不同組織的表達量變化在脂肪沉積過程中發揮調控作用（張斌等，2016;相德才等，2017;Li et al.，2018）。奶牛ADFP基因超表達會促進乳腺上皮細胞中脂滴含量的顯著增加（龐坤等，2019）。大量相關研究表明，ADFP基因與肌內脂肪沉積有關，可將ADFP基因作為調控豬肌內脂肪沉積的一個候選基因。Kim等（2005）研究發現ADFP基因可作為豬肌內脂肪沉積和大理石紋特征的候選基因。ADFP基因多態性與酮體性狀具有相關性，且ADFP基因表達量在脂肪含量較高的組織中呈升高趨勢（Davoli et al.，2010）。顧麗菊等（2016）研究表明ADFP基因在地方豬不同組織中的差異表達與脂肪沉積有關。Cui等（2016）研究3個豬品種肌肉中ADFP基因相對表達量時，發現ADFP基因在豬的脂肪沉積和調節中存在相關性。Zhao等（2020）發現ADFP基因表達水平差異與豬肌內脂肪含量高低有關。【本研究切入點】迪慶藏豬為云南地方良種，屬于典型的高原藏豬種，具有抗逆性強、耐高寒、耐缺氧、耐粗飼、瘦肉率高及肉鮮嫩等優點，且香味特殊、營養豐富（國家畜禽資源委員會，2011）。肌內脂肪（Intramuscular fat， IMF）含量是評價豬肉品質的一個重要指標，與肉的嫩度、含水量和口感呈正相關（Wood et al.，2004;Lu et al.，2008;Hausman et al.，2009），但至今有關ADFP基因調控迪慶藏豬肌內脂肪沉積過程及脂肪沉積遺傳規律的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】利用PCR擴增測序和實時熒光定量PCR分析ADFP基因多態性變化對ADFP基因在迪慶藏豬各組織中相對表達量的影響，從分子遺傳學方面闡述迪慶藏豬不同基因型在不同組織中脂肪沉積過程中的影響，為建立迪慶藏豬的分子標記篩選和分子標記輔助育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料的采集和保存

隨機挑選6月齡的迪慶藏豬共113頭，采集耳組織，置于裝有75%酒精的凍存管中，-70 ℃保存。挑選其中13頭迪慶藏豬進行屠宰試驗，采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腿肌、胸肌和皮下脂肪等組織樣品，立即置于裝有RNA Save液的凍存管中，-70 ℃保存。

1. 2 基因組DNA的提取、擴增及多態性檢測

1. 2. 1 基因組DNA提取 使用組織/血液基因組DNA提取試劑盒提取迪慶藏豬耳組織DNA，提取步驟參見試劑盒說明書，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果。

1. 2. 2 引物設計 利用Primer Premier 5.0，參考GenBank已發布的豬ADFP全基因序列（NC_010443.5），對迪慶藏豬ADFP基因設計1對特異性引物（F：5'-CCCTATCTCCCCATGAAAATATGC-3';R：5'-CAGT GGTGTTCTAGAAGCTAAGAG-3'），目的片段為1262 bp，委托英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1. 2. 3 PCR擴增及測序 使用Master Mix試劑對113頭迪慶藏豬耳組織DNA樣品進行PCR擴增，25.0 μL擴增體系：Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，DNA模板（約50 ng）2.0 μL，補ddH2O至25.0 μL。擴增反應條件：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行40個循環;72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，檢測合格后送至中美泰和生物技術（北京）有限公司進行單向（正向）測序。

1. 2. 4 多態性位點（SNPs）檢測及遺傳分析 使用DNASTAR 5.0進行序列比對檢測SNPs，SeqMan軟件分析SNPs。參考張斌等（2020）的方法計算：多態性（SNP）位點的基因型頻率Xa=（2Naa+Nab）/2N，式中，Xa為等位基因a的頻率，Naa為基因型aa的個體數，Nab為基因型ab的個體數，N為個體總數;等位基因頻率Xaa=Naa/N，式中，Xaa為基因型aa的頻率，Naa為基因型aa的個體數，N為總的個體數;雜合度He=1-Σ（Pi）2，式中，Pi表示某群體第i個等位基因的基因頻率;多態信息含量PIC=1?[i=1nP2i?i=1n=1j=i+1n2P2iP2j]，式中，Pi和Pj分別表示第i和第j個等位基因在群體中的頻率，n為等位基因數。

1. 3 基因表達量檢測

1. 3. 1 總RNA提取及反轉錄 總RNA提取采用天根TRNzol-A+總RNA試劑直接從組織中提取總RNA。利用超微量核酸蛋白分析儀檢測RNA純度（OD260/OD280=1.8～2.0）。使用天根FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒中的反轉錄試劑合成cDNA，反應條件參見試劑盒說明書。

1. 3. 2 引物設計 利用Primer Premier 5.0針對目的基因ADFP（XM_005660075.3）mRNA區域設計了1對引物，內參基因GAPDH（NM_205518.1）基因引物參考前人已發表的引物（張斌等，2020）（表1）。

1. 3. 3 實時熒光定量PCR 使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進行熒光實時定量PCR試驗，優化后的反應體系（20.0 μL）： 2×SuperReal PreMix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL;cDNA 1.0 μL;補ddH2O至20.0 μL。每個樣品設置3個重復。定量擴增條件：95 ℃ 3 s;60 ℃ 30 s;72 ℃ 20 s，循環40次，最后增加熔解曲線。

1. 4 統計分析

使用Excel 2010計算各樣品Ct值，利用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。運用SPSS 20.0完成目的基因相對表達量間的多重比較（Duncan法）。

2 結果與分析

2. 1 迪慶藏豬ADFP基因PCR擴增及序列分析結果

迪慶藏豬ADFP基因目的片段PCR擴增結果如圖1，擴增產物無非特異性擴增。且擴增片段與引物設計片段大小一致。

對113份PCR擴增產物進行測序分析，測序結果與GenBank已公布的豬ADFP基因序列一致。在測序序列中發現3個SNPs（SNP1、SNP2和SNP3），均位于外顯子6上，均只存在2種基因型（圖2），分別是SNP1（C→T）、SNP2（C→T）和SNP3（T→C）。

2. 2 迪慶藏豬ADFP基因SNPs位點的遺傳分布情況

由表2可知，在迪慶藏豬群體中，ADFP基因SNP1、SNP2和SNP3位點的優勢基因型分別為CC型（0.70）、CC型（0.85）和CT型（0.74），優勢等位基因分別為C（0.88）、C（0.92）和T（0.63）。通過計算各SNPs位點的He和PIC，發現迪慶藏豬群體中SNP1和SNP2位點屬于低度多態（PIC/He<0.25），而SNP3位點屬于中度多態（0.25<PIC/He<0.5），說明迪慶藏豬ADFP基因SNP1和SNP2位點自然選擇和人工選擇程度較大，而SNP3位點自然選擇和人工選擇程度較小。

2. 3 迪慶藏豬不同組織中ADFP基因的相對表達量

對13頭迪慶藏豬不同組織樣品進行目的基因和內參基因相對表達量檢測，通過觀察熔解曲線（圖3）可看出，目的基因和內參基因的實時熒光定量PCR熔解曲線單一，沒有產生引物二聚體和非特異性產物，說明2個基因的實時熒光定量PCR擴增效果良好。

以編號892迪慶藏豬心臟組織中ADFP基因Ct值的平均值為對照，計算其余迪慶藏豬各組織中ADFP基因的相對表達量。由圖4可知，ADFP基因在迪慶藏豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌、腿肌和皮下脂肪等組織均有表達，皮下脂肪中ADFP基因的相對表達量顯著高于其他組織中ADFP基因的相對表達量（P<0.05，下同），肺臟中ADFP基因的相對表達量顯著高于心臟、背肌和腿肌中ADFP基因的相對表達量。

2. 4 不同基因型對迪慶藏豬群體中ADFP基因表達的影響

由圖5可知，在13頭迪慶藏豬3個SNPs位點純合和雜合群體中，皮下脂肪中ADFP基因相對表達量都是最高的，且顯著高于其他組織中ADFP基因相對表達量。如圖5-A所示，在迪慶藏豬SNP1位點純合（CC）群體中，肝臟和肺臟中ADFP基因相對表達量顯著高于心臟、背肌和腿肌中ADFP基因相對表達量;在雜合（CT）群體中，肝臟和肺臟中ADFP基因相對表達量顯著高于心臟、背肌和腿肌中ADFP基因相對表達量。如圖5-B所示，在迪慶藏豬SNP2位點純合（CC）群體中，肝臟和肺臟中ADFP基因相對表達量顯著高于其他組織（除皮下脂肪）中ADFP基因相對表達量;在雜合（CT）群體中，肝臟和腎臟中ADFP基因相對表達量顯著高于心臟、脾臟、肺臟、背肌和腿肌中ADFP基因相對表達量。在迪慶藏豬SNP3位點純合（CC）群體中，ADFP相對表達量趨勢與SNP2位點純合（TT）群體中表達量趨勢相同;在雜合（CT）群體中，肺臟和腎臟中ADFP基因相對表達量顯著高于其他組織（除皮下脂肪）中ADFP基因相對表達量。

迪慶藏豬不同基因型群體不同組織中ADFP基因相對表達量如圖6所示。由圖6-A和圖6-C可知，在迪慶藏豬SNP1和SNP3位點不同基因型群體中，ADFP基因相對表達量在純合基因型群體和雜合基因型群體各組織中均無顯著差異（P>0.05，下同）。由圖6-B可知，在迪慶藏豬SNP2位點不同基因型群體中，雜合基因型群體腎臟中ADFP基因相對表達量顯著高于純合基因型群體腎臟中ADFP基因相對表達量，在2個基因型群體其他組織中ADFP基因相對表達量無顯著差異。

3 討論

在許多不同類型的哺乳動物細胞中，細胞內的中性脂質儲存在由三酰基甘油和膽固醇酯核心組成的離散脂滴中（Brasaemle et al.，1997）。ADFP是一種脂滴相關蛋白，最初在脂肪分化早期時作為誘導蛋白被發現。Kim等（2005）研究發現在多個豬種中ADFP基因均存在多態性，并推測ADFP可能是豬脂肪沉積的候選基因。趙雪蓮（2005）克隆獲得梅山豬第4、第5和第7內含子序列，在與韓國本土豬ADFP基因結構比較時發現，梅山豬在第4內含子和第7內含子上均發生了SINE缺失。顧麗菊等（2015）在2個豬種ADFP基因中篩查到5個SNPs，其引起ADFP基因mRNA二級結構、編碼蛋白二級結構及三級結構變化。本研究對迪慶藏豬ADFP基因進行了多態性檢測，在第6外顯子上檢測出3個SNPs位點，分別是SNP1（C→T）、SNP2（C→T）和SNP3（T→C），針對不同基因型的迪慶藏豬群體進行了不同組織中ADFP基因相對表達量分析。

脂肪沉積過程中ADFP基因主要調控甘油三酯的形成，所以不同組織中ADFP基因表達水平也可從另一個方面反映該組織脂肪沉積潛力。已有研究表明，在大多數的脂質聚集細胞中均發現了ADFP表達（Mishra et al.，2004），且ADFP表達是脂質聚集的標志（Jiang et al.，1992）。ADFP基因在畜禽不同組織中均有表達，不同組織中也存在差異表達（崔景香，2011;Xiang et al.，2017;Li et al.，2018;Zhang et al.，2019）。ADFP表達水平可調控多種細胞內的脂肪含量，ADFP基因過表達或欠表達能增加或降低細胞內脂肪含量（Chang et al.，2006）。趙雪蓮（2005）利用半定量RT-PCR檢測發現ADFP基因在梅山豬腦和脂肪組織中的表達量最高，其次為睪丸、肝臟、心臟、脾臟、腸和肌肉組織，在腎臟中的表達量最低。顧麗菊等（2016）研究發現ADRP基因在地方豬不同組織中均有表達，且不同組織中的差異表達可能與脂肪沉積有關。本研究利于實時熒光定量PCR方法檢測迪慶藏豬不同組織中ADFP基因表達水平，發現在8種組織中均有表達且存在一定差異，在皮下脂肪中的表達量最高，具體表現為皮下脂肪>肺臟>肝臟>脾臟>腎臟>腿肌>背肌>心臟，與前人研究結果存在一些差異。ADFP基因在豬前體脂肪細胞分化過程中起到促進作用，同時與脂滴的形成相關，能上調脂滴的含量（趙永艷，2014）。Davoli等（2010）研究表明意大利杜洛克豬ADFP基因多態性與酮體性狀具有相關性，且肌間脂肪含量較高的豬ADFP基因表達水平較高。Zhao等（2020）研究發現ADFP基因在肌內脂肪含量較高的組織中表達量比在肌內脂肪含量較低的組織中表達量高，且存在顯著性差異，說明ADFP基因可能與豬肌內脂肪含量高低有關。本研究分析了ADFP基因多態性在不同迪慶藏豬群體中對ADFP基因相對表達量的影響，結果發現不同基因型迪慶藏豬ADFP基因在不同組織中也存在顯著差異表達;另外，ADFP基因在SNP2位點雜合群體腎臟中相對表達量顯著高于純合群體腎臟中相對表達量，表明ADFP基因SNPs變異對迪慶藏豬組織中ADFP基因表達具有影響。

4 結論

ADFP基因在迪慶藏豬不同組織中均有表達，并存在差異表達。ADFP基因SNPs變異對迪慶藏豬組織中ADFP基因表達會產生差異表達，進而影響機體脂肪沉積，SNP2位點可作為迪慶藏豬選育工作的一個分子遺傳標記。

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（責任編輯 鄧慧靈）