小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因克隆與蛋白表達

周爽爽 劉榮

摘 ? ?要：本試驗克隆了小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii Matsuda）（原常稱為假眼小綠葉蟬）的化學感受蛋白基因14（EonuCSP14）（GenBank后登錄號為4YZPC5X701R），通過原核表達體系獲得其重組蛋白，并通過蛋白純化體系獲得了純蛋白，為小貫小綠葉蟬化學感受蛋白的功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：小貫小綠葉蟬;化學感受蛋白;基因克隆;蛋白表達

文章編號：1005-2690（2021）24-0016-02 ? ? ? 中國圖書分類號：Q966;S435.711 ? ? ? 文獻標志碼：B

小貫小綠葉蟬是茶樹上為害較廣的害蟲，其為害嚴重威脅著我國的茶葉產量[1-2]。在關于害蟲的綠色生態防控技術研究中，昆蟲嗅覺識別機制是研究熱點之一[3]。化學感受蛋白CSPs是存在于昆蟲感器淋巴液中一類水溶性蛋白，分子量較小，其氨基酸序列具有Cys位點數量及位置保守的特征，是昆蟲識別、運輸外界化學信息物質的重要蛋白之一[4]，對CSPs功能的研究有助于完善昆蟲嗅覺識別機制[5]。

1 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因克隆及分析

供試蟲源采集于貴州省都勻市（26°13′E，107°30′N）茶園中，于冰上切下其觸角并立即投入液氮保存備用。用Invitrogen公司的Trizol試劑提取葉蟬觸角總RNA。用試劑盒合成cDNA第一條鏈。通過NCBI獲得EonuCSP14基因序列，利用Primer 5.0設計引物后，由生物公司合成。經PCR擴增體系得到目的基因產物，電泳后利用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit回收PCR產物，與pMD-18T Vector一起水浴（42 ℃，4 h），獲取重組質粒，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。挑取單克隆測序，比對獲得目的基因克隆體。利用“http：//web.expasy.org/compute_pi/”預測等電點、分子量，利用“http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/”預測N-末端信號肽序列。

2 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14的原核表達及純化

試驗菌株：克隆菌株pMD-18T-EonuCSP14-DH5，pET-32b空載體表達菌株。

主要儀器：SDS-PAGE蛋白電泳系統，蛋白純化儀，超聲波細胞粉碎機，酶標儀。

2.1 ? 提取質粒

將克隆菌株、pET-32b空載體表達菌株，分別接入LB培養基中培養，通過大腸桿菌菌液提取質粒的方法，分別提取含有目的基因的克隆菌株質粒和pET-32b空表達載體質粒。

2.2 ? 原核表達載體的構建

在37 ℃水浴條件下，將EcoRI（1 μL）、XhoI（1 μL）、質粒（30 μL）、10×H Buffer（5 μL）、ddH2O（13 μL）混合反應3 h，分別將克隆菌株質粒和空表達載體質粒進行酶切。電泳檢測酶切產物，回收目的基因。在16 ℃水浴條件下，將目的基因回收產物（6.5 μL）、表達載體回收產物（2 μL）、10×T4 ligase Buffer（1 μL）、T4 DNA ligase（0.5 μL）混合反應4 h，將目的基因連接到表達載體pET-32b上，轉化到克隆菌株后提取單克隆測序。用正確的菌株提取質粒，再轉化到表達菌株BL21（DE3）。測序確定正確的單克隆后，保存菌液，用于目的蛋白表達。

2.3 ? 目的蛋白的試表達及檢測

將上報保存的菌液搖菌活化（37 ℃，220 r/min），培養過夜。次日，用含有對應抗生素的LB培養液，按1∶100的比例擴大培養（37 ℃，220 r/min），直至菌液OD600在0.6～0.8之間，加入誘導劑（IPTG）誘導蛋白表達，37 ℃繼續培養3 h（取未誘導菌液作為CK）。

誘導后，取菌液離心（100 μL），保留上清13 μL重懸，沸水浴10 min（加入8 μL4×蛋白樣品緩沖液，保護目的蛋白），室溫短暫離心1 min。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測蛋白表達情況。確定表達后，收集菌液進行細胞破碎，檢測蛋白可溶性。

2.4 ? 靶蛋白的大量表達

試表達成功后，進行大量表達。擴大培養后4 ℃離心收集菌體，按50∶1加入Tris-HCl（30 mmol/L，pH值7.4）洗滌溶解。菌體溶解液，反復凍融2～3次后保存于-20 ℃備用。

2.5 ? 靶蛋白的純化及酶切

將上述菌體加入蛋白酶抑制劑后超聲破碎，收集上清利用鎳柱親和層析法進行純化酶切標簽獲得純蛋白，再進行SDS-PAGE電泳檢測[6]。

2.6 ? 蛋白濃度的測定及結合物質配制

根據Bradford蛋白定量檢測試劑盒說明書，測定蛋白濃度。熒光探針配制：先用色譜級甲醇將熒光探針（1-NPN）配制母液（100 mmol/L），再稀釋成工作液（1 mmol/L），保存于-20 ℃。

2.7 ? 熒光探針適合性測定

將1-NPN工作液逐一加入上述試驗保存的EonuCSP14蛋白溶液中（2 μmol/L），終濃度梯度范圍為0～50 μmol/L。在熒光分光光度計中檢測熒光值，計算解離常數K1-NPN，分析EonuCSP14蛋白與該探針的競爭性結合適應性。如果1-NPN和EonuCSP14蛋白的結合具有飽和效應，Scatchard分析呈線性化關系，說明1-NPN可用于該蛋白的后續競爭性結合試驗。

3 ? 結果與分析

3.1 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因克隆結果

通過PCR獲得了目的基因擴增片段，通過轉化，挑取單克隆測序，確定獲得EonuCSP14基因的克隆菌株。本次試驗克隆的EonuCSP14基因大小為402 bp，以DL2000Marker作對照，擴增產物大小與預測大小相符合（圖1）。

3.2 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因序列分析

本次試驗中克隆的EonuCSP14基因，具有完整的開放閱讀框，大小為402 bp，編碼133個氨基酸;經預測網址預測顯示，EonuCSP14分子量為14.99，等電點為8.99，包含21個氨基酸組成的信號肽。

3.3 ? 重組質粒的構建及目的蛋白的表達

成功構建了以pET-32b為表達載體的重組質粒。轉化得到的表達菌株，在常規條件下誘導3 h（37 ℃，220 r/min，IPTG終濃度0.1 mmol/L），成功表達了目的蛋白。細胞破碎后檢測表明目的蛋白可溶，即上清中存在融合蛋白。細菌裂解液經洗脫、酶切去除標簽、純化得到了目的蛋白（圖2）。因目的蛋白含有信號肽，在表達純化過程中去除了信號肽，因此純化后的目的蛋白分子量小于14.99。

3.4 ? 蛋白濃度的測定

按照Bradford蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。利用標準蛋白的終濃度制成的標準曲線，相關系數r2=0.99，說明測得的蛋白濃度可信。

3.5 ? 熒光探針適合性檢驗

經檢測，隨著1-NPN濃度的增加，蛋白與探針結合的熒光值相應升高，最后趨于飽和（圖3）;檢測結果通過Scatchard分析后呈線性化關系（圖4），說明1-NPN與EonuCSP14蛋白的結合是一對一的結合，可作為競爭結合試驗探針。

參考文獻：

[1]肖強.“張冠李戴”話茶小綠葉蟬[J].中國茶葉，2019（5）：14-16.

[2]曹馨月，王迎春，龔雪蛟，等.小貫小綠葉蟬區域性發生規律和綜合防治[J].中國植保導刊，2018，38（12）：25-32.

[3]袁爭，張亮，孫欽玉，等.茶小綠葉蟬綜合治理技術研究進展[J].中國茶葉加工，2010（4）：13-18.

[4]劉孝賀，孫麗娜，張懷江，等.昆蟲化學感受蛋白研究進展[J].農學學報，2020，10（6）：22-26.

[5]王曉雙，唐良德，吳建輝.昆蟲嗅覺相關蛋白的研究進展[J].熱帶作物學報，2017，38（6）：1171-1179.

[6]許沖.班氏跳小蜂氣味結合蛋白嗅覺功能分析[D].武漢：華中農業大學，2020.