桑葉提取物和1-脫氧野尻霉素對大鯢生長性能、肝臟功能及免疫能力的影響

盧 樺 李戰福 黃先智 李 虹 翟旭亮 薛 洋 劉長江 徐杭忠 羅 莉*

(1.西南大學水產學院，水產科學重慶市重點實驗室，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，重慶400715；2.家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶400715；3.重慶市水產技術推廣總站，重慶401121)

桑葉提取物(mulberry leaf extract，MLE)因含有大量的多糖類、黃酮類、生物堿類、植物甾醇類等活性物質而備受關注[1]，但其作為飼料添加劑在水產養殖上的應用較少。本課題組研究發現，飼料中添加7.3～7.5 g/kg的MLE可顯著增加大鯢(Andriasdavidianus)攝食量，并提高其腸胃消化吸收、肝臟抗氧化及機體免疫能力[2]。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是一種多羥基哌啶生物堿，因具有降血糖、降血脂、抗病毒、抗腫瘤及抗氧化等生物活性而被認為有較高的食用價值和藥用價值[3-4]。盡管這些特性使得DNJ在食品和醫藥領域廣泛應用，但關于NDJ作為功能性飼料添加劑在水產動物中的應用研究尚未見報道。

大鯢為我國特有且體型最大的珍稀兩棲動物，原生態、仿生態和工廠化養殖3種模式的大鯢人工養殖技術已經基本成熟且已形成一定規模。目前，對大鯢人工配合飼料的研究報道很少，且停留在基礎性的營養需求探索及動物餌料之間或單純的人工飼料與天然餌料之間的對比階段[5-7]。人工養殖過程中還是以鮮活魚蝦為主要飼料，人工規模化養殖難以推行。本課題組前期已成功研發能滿足大鯢生長過程中營養供給的人工配合飼料，在重慶、四川、貴州、廣西等多地的養殖基地通過試驗證明其均保持較低的飼料系數 ( feed conversion ratio， FCR )[2]。另外，因MLE中含有DNJ，但MLE和DNJ分別添加在大鯢飼料中的效果差異不得而知。鑒于此，本試驗旨在研究MLE和DNJ對大鯢生長性能、肝臟功能及免疫能力的影響，為生產安全、綠色、優質的大鯢人工配合飼料添加劑的選擇及應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選用的大鯢購于陜西省漢中市綠源大鯢養殖場，MLE由西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室提供，DNJ(高相液相色譜分析標準品，其純度≥98%)購于北京世紀奧科生物技術有限公司，飼料所需原料均購于重慶市大發飼料有限公司。

以魚粉、雞肉粉等為蛋白質源，以大豆油為脂肪源，配制大鯢基礎飼料；在基礎飼料中分別添加7.5 g/kg的MLE和0.04 g/kg的DNJ(MLE添加量參照本課題組前期試驗[2]，該添加量下飼料中DNJ實測含量為0.04 g/kg)，經膨潤土調平，配制成3種等氮等脂的試驗飼料。試驗飼料組成及營養水平見表1。飼料原料均過40目篩，用混合制粒機(四川棉豐農業機械制造廠9FZ-35C型)制成直徑3 mm、長6～8 mm的軟顆粒飼料，冷卻后低溫晾干，再用雙層塑料袋包裝并封口，置于-20 ℃冰柜中保存備用。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)

1.2 試驗設計與飼養管理

選擇初始均重為(47.81±0.23) g的大鯢72尾，隨機分為3組，每組3個重復，每個重復8尾。對照組飼喂基礎飼料，試驗組分別飼喂基礎飼料中添加7.5 g/kg MLE(MLE組)和0.04 g/kg DNJ(DNJ組)的試驗飼料。試驗期90 d。

試驗大鯢購回后靜養2 d，用1%氯化鈉溶液浸泡消毒5 min，饑餓暫養5 d再以大鯢基礎飼料馴食15 d，待大鯢體質恢復后開展正式試驗。試驗大鯢放養在室內藍色塑料方形箱(70.5 cm×45.5 cm×17.5 cm，水深5 cm)中，水源為經12 h曝氣的自來水。因大鯢消化食物時間較長，故連續投喂2 d間歇1 d，每天1次(17:00)，飽食投喂，投喂當天(20:00)及時用網孔密集的網兜收集殘余餌料并計重。每天早晚各換水1次。飼養期間避光，水溫19～22 ℃，溶解氧含量>6.0 mg/L，氨氮含量<0.10 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.10 mg/L，pH在6.5～7.5。

1.3 樣品采集與制備

養殖試驗結束后，試驗大鯢停喂3 d，用MS-222(0.1 g/L)麻醉后，每組每個重復的8尾大鯢全用于體質量、體長的測定。其中5尾大鯢在冰盤中解剖，用1 mL無菌注射器吸取1%肝素鈉進行腹部動脈采血，4 ℃靜置3 h后，4 000 r/min離心提取血漿，立即放入液氮速凍，后置于-80 ℃冰箱中，用于血漿生化指標測定；采血后取出內臟并稱重，分離出肝臟，用磷酸鹽緩沖液(PBS)小心沖洗，并將肝臟迅速液氮速凍，后置于-80 ℃冰箱中，用于肝臟營養成分及相關酶活性測定；將背部肌肉皮膚去除后取出肌肉，置于-80 ℃冰箱中，用于肌肉營養成分測定。

1.4 指標測定

生長性能指標測定：養殖試驗結束后，停食3 d，準確稱量各組大鯢體重、內臟重和殘餌重，計算其增重率(weight gain rate，WGR)、攝食量(feed intake，FI)、特定生長率(specific growth rate，SGR)、FCR和存活率(survival rate，SR)，計算公式如下：

WGR(%)=100×(Wt-W0)/W0；
FI(g/尾)=(∑F0-∑Fr)/Nt；
SGR(%/d)=100×(lnWt-lnW0)/d；
FCR=F/(Wt-W0)；
SR(%)=100×Nt/N0。

式中：W0為起始均重(g)；Wt為終末均重(g)；d為養殖試驗天數(d)；F0為每次投喂量(g)；Fr為每次殘餌量(g)；F為攝食量(g)；N0為初始尾數；Nt為終末尾數。

試驗飼料及組織常規營養成分的測定：水分、粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分含量分別采用105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2006)、凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)、索氏抽提法(GB/T 6433—1994)、550 ℃灼燒法(GB/T 6438—1992)進行測定。肝臟粗脂肪含量采用氯仿-甲醇法測定。

肝臟抗氧化指標的測定：肝臟總抗氧化能力(T-AOC)及總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。

肝臟功能和血漿免疫指標的測定：血漿肉堿棕櫚酰轉移酶-1(CPT-1)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)活性和免疫球蛋白M(IgM)、活性氧(ROS)含量均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。

1.5 數據處理

試驗結果用SPSS 22.0對數據進行方差齊性檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏多重比較法分析組間差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。數據用平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結 果

2.1 MLE和DNJ對大鯢生長性能及飼料利用的影響

由表2可知，MLE組和DNJ組的終末均重、WGR、SGR和FI均顯著高于對照組(P<0.05)，而MLE組和DNJ組之間無顯著差異(P>0.05)。MLE組和DNJ組的WGR較對照組分別升高了38.88%和45.55%。MLE組和DNJ組的FCR均顯著低于對照組(P<0.05)，較對照組分別降低了17.39%和21.74%。各組大鯢存活率均為100%。

2.2 MLE和DNJ對大鯢肌肉和肝臟營養成分的影響

由表3可知，MLE組和DNJ組的肌肉和肝臟粗脂肪含量均顯著低于對照組(P<0.05)。MLE組和DNJ組的肌肉粗蛋白質含量顯著高于對照組(P<0.05)，較對照組分別升高了13.13%和8.31%。MLE組的肌肉水分含量顯著低于對照組(P<0.05)，MLE組和DNJ組的肝臟水分含量顯著低于對照組(P<0.05)。

表2 MLE和DNJ對大鯢生長性能及飼料利用的影響

表3 MLE和DNJ對大鯢肌肉和肝臟營養成分的影響(鮮樣基礎)

2.3 MLE和DNJ對大鯢肝臟功能的影響

2.3.1 MLE和DNJ對大鯢肝臟脂質代謝指標的影響

由圖1可知，MLE組和DNJ組的血漿CPT-1、ACC活性及CPT-1/ACC均顯著高于對照組(P<0.05)，且DNJ組的血漿CPT-1、ACC活性及CPT-1/ACC顯著高于MLE組(P<0.05)。

2.3.2 MLE和DNJ對大鯢肝臟抗氧化指標的影響

由表4可知，MLE組和DNJ組的肝臟T-AOC、T-SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，肝臟MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)。MLE組的肝臟T-AOC、T-SOD活性顯著高于DNJ組(P<0.05)，肝臟MDA含量顯著低于DNJ組(P<0.05)。

2.3.3 MLE和DNJ對大鯢血漿轉氨酶活性的影響

由圖2可知，MLE組和DNJ組的血漿AST和ALT活性顯著低于對照組(P<0.05)，MLE組的血漿AST和ALT活性顯著低于DNJ組(P<0.05)。

2.4 MLE和DNJ對大鯢血漿IgM和ROS含量的影響

由圖3可知，MLE組和DNJ組的血漿IgM含量顯著高于對照組(P<0.05)，MLE組的血漿IgM含量顯著高于DNJ組(P<0.05)。MLE組和DNJ組的血漿ROS含量顯著低于對照組(P<0.05)，DNJ組的血漿ROS含量顯著低于MLE組(P<0.05)。

數據柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

表4 MLE和DNJ對肝臟抗氧化指標的影響

圖2 MLE和DNJ對大鯢血漿轉氨酶活性的影響

圖3 MLE和DNJ對大鯢血漿IgM和ROS含量的影響

3 討 論

3.1 MLE和DNJ對大鯢生長性能及飼料利用的影響

MLE中的某些活性物質已應用于多種動物飼料并在改善動物生長性能方面有良好的飼用價值。在斷奶犢牛[8]、綿羊[9]上的研究證實，適宜桑葉黃酮的添加有利于改善胃腸道結構、增強相關消化酶活性，從而提升了動物對營養物質的消化吸收能力。本研究結果顯示，飼料中添加MLE和DNJ能促進大鯢生長，與對照組相比，MLE組和DNJ組的FCR顯著降低，WGR顯著提高。這說明大鯢的生長性能得到改善，飼料中添加MLE和DNJ具有同等效應。MLE中的多種單體活性物質可通過不同方式促進不同種類動物的生長，因而MLE具有多種單體物質聯合產生協同效應的優勢。Li等[10]發現DNJ可特異性調節高脂飲食小鼠腸道菌群，更好地參與機體能量代謝和營養物質吸收過程，進而影響機體生長狀況。本研究結果也顯示，MLE中的DNJ對大鯢的生長有同樣的促進效果。關于DNJ促進機體生長發育機制有待進一步研究。與以上結果不同的是，在育肥豬上的研究顯示，桑葉粉的添加會降低其生長性能[11]。一方面，養殖對象的不同、桑葉的不同加工處理方式或添加量可能對生長性能造成不同效果；另一方面，高劑量的添加也增加了其中抗營養物質的含量，從而阻止機體對營養物質的吸收。作為植物性添加劑，MLE和DNJ的添加反而增加了大鯢的FI，這與在犢牛上的研究結果[8]一致；這可能與MLE特征性的氣味具有一定誘食性有關。本研究團隊在前期的研究中已證實，適量添加MLE可提高大鯢消化吸收酶活性并改善腸道發育狀況，從而促進其對營養物質的消化吸收和利用[2]。因而，MLE和DNJ促進大鯢生長的原因可能是大鯢攝食量、消化吸收能力、生長性能三者之間相互作用。

3.2 MLE和DNJ對大鯢體組成的影響

本研究表明，MLE在增加肌肉粗蛋白質含量方面的效果顯著優于DNJ。這可能是由于MLE中含有甾醇，它可在機體內形成植物甾醇核糖核蛋白復合體，該復合體具有促進動物蛋白質合成的功能[12]。桑葉中氨基酸含量豐富，尤其是必需氨基酸，因此可作為飼料強化劑，與其他氨基酸互補，有利于蛋白質在體內的合成[13]。同時，兩者的添加都能降低肌肉和肝臟的粗脂肪含量。王玲等[14]研究發現，DNJ對控制飲食的肥胖大鼠重量的主要調控途徑是通過調節脂肪細胞因子的分泌來控制脂肪酸代謝過程中的相關酶活性，進而減少脂肪積累。大鯢相比其他魚類其水分含量高，粗脂肪含量低。本研究中，飼料中添加MLE和DNJ均能降低大鯢肌肉水分和粗脂肪含量，因而機體粗蛋白質占比有所提升。這也為生產優質動物產品以及拓寬飼料桑葉或MLE新用途提供了新思路。

3.3 MLE和DNJ對大鯢肝臟功能的影響

大鯢作為兩棲類動物已進化出獨立的肝臟且在機體中占有重要地位，肝臟承擔體內代謝、排泄和解毒等重要生理功能，最能反映機體的營養、生理和病理狀態[15]。

3.3.1 MLE和DNJ對大鯢肝臟脂質代謝指標的影響

眾所周知，桑葉不僅在改善動物生長性能方面效果良好，且因其具降血糖、降血脂[16]功能而引起醫藥、畜禽飼料行業的廣泛關注。本試驗結果表明，飼料中添加MLE和DNJ均能顯著提高血漿中作為β-氧化的關鍵限速酶CPT-1和脂肪酸從頭合成途徑關鍵限速酶ACC的活性。這表明兩者均可通過影響與肝臟脂質代謝相關的酶活性而達到調節脂質代謝的目的。在小鼠上的研究認為MLE的降血脂作用歸因于抑制脂質合成和促進脂質降解[17]。此外，DNJ可刺激腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)mRNA的表達，一定程度上激活動態平衡中脂肪酸β-氧化系統AMPK→ACC→CPT-1通路，從而抑制脂質在肝臟的聚積及肌內脂肪沉積[18]。與此同時，MLE組和DNJ組的CPT-1/ACC顯著高于對照組，則進一步說明大鯢整體脂肪酸分解代謝能力強于合成代謝能力，這也與肝臟中粗脂肪的含量在添加MLE和DNJ后表現為降低相符合，更進一步證實了MLE和DNJ可減少脂肪在肝臟的儲存，因而對肝臟功能的健康有積極影響。

3.3.2 MLE和DNJ對大鯢肝臟抗氧化指標的影響

T-AOC和T-SOD活性大小代表生物體清除體自內由基能力，是抗氧化系統功能的重要指標，在免疫系統中也有極為重要的作用[19]。本研究中，飼料中添加MLE和DNJ提高了肝臟T-AOC和T-SOD活性，且MLE的添加效果更優。MLE可增強抗氧化指標的活性與MLE應用于吉富羅非魚上的研究結果[20]一致。這可能與MLE中含有豐富的黃酮類化合物槲皮素、蕓香苷、生物堿化合物DNJ及其衍生物[21]以及多糖、多酚等[22-23]具有清除自由基、抗氧化功能的多種活性物質共同作用的結果。Horng等[24]證實MLE具有保護小鼠肝臟免受對乙酰氨基酚(APAP)誘導的炎癥作用，其保護機制可能與MLE調節抗氧化狀態、降低氧化應激有關。目前，NDJ作為單體應用于動物人工配合飼料中的研究仍是空白。在本研究中，DNJ應用于大鯢基礎飼料中在抗氧化能力方面的效果不及MLE。脂質過氧化可誘導機體產生炎癥反應，MDA正是脂質過氧化物穩定的終產物，可反映出細胞受損傷的程度[25]。本試驗中，飼料中添加MLE和DNJ后肝臟MDA含量均顯著降低，可進一步證實MLE和DNJ的攝取和補充通過提升肝臟T-AOC和T-SOD活性來增加大鯢抗氧化能力，減少氧化應激，從而清除自由基和ROS，降低MDA含量，減緩肝臟發生脂質過氧化的程度并提高非特異性免疫，最終達到保證肝臟行使其正常功能的目的。

3.3.3 MLE和DNJ對大鯢血漿轉氨酶活性的影響

AST和ALT主要存在于肝臟細胞中，機體早期肝臟受損或疾病常伴有血液中AST和ALT活性的升高。本研究結果表明，飼料中添加MLE和DNJ顯著降低了血漿AST和ALT活性，且MLE組的血漿AST和ALT活性顯著低于DNJ組。這表明MLE和DNJ的添加對大鯢肝功能具有改善作用，因此，因肝損傷進入血液中的AST和ALT活性有所降低。這也進一步證實MLE和DNJ可以有效保護脂肪對肝細胞的傷害，進而改善肝臟健康，且MLE的作用效果優于DNJ。

3.4 MLE和DNJ對大鯢免疫能力的影響

研究表明，眾多植物提取物中的活性物質因對免疫系統有一定的影響而被用作免疫應答調節劑[26-27]。本研究表明，飼料中添加MLE和DNJ顯著提高了血漿IgM含量，但DNJ提升效果不及MLE。目前，關于MLE對動物免疫能力的改善多集中在桑葉多糖的研究上，IgM作為血液循環中的主要抗體之一，參與中和抗原和促進抗原吞噬等重要的體液免疫反應[28]，陳曉蘭等[29]研究表明，桑葉粗多糖和桑葉水提物在合適濃度下能促進小鼠脾臟B、T淋巴細胞的增殖。Zhao等[30]將桑葉多糖與桑葉黃酮共同應用于斷奶仔豬飼糧中可增強免疫能力，降低腹瀉發生率。ROS是細胞信號傳導、基因表達、細胞增殖調控的胞內信使，其含量異常將導致氧化應激和抗氧化防御間平衡失調，進一步破壞機體免疫能力甚至組織損傷[31]。本試驗中，飼料中添加MLE和DNJ顯著降低了血漿ROS含量，這說明ROS的產生受到抑制或已產生的ROS得到清除。這些研究結果表明，MLE具有一定的免疫調節作用。本研究認為MLE中的多糖或與MLE中的多酚、DNJ等活性物質共同作用改善大鯢的免疫能力，而DNJ作為單體作用效果不如MLE。兩者均具有一定的清除ROS效果，DNJ對ROS清除效果更佳，其具體機理有待進一步研究。

4 結 論

① 飼料中添加MLE和DNJ均能改善大鯢的生長性能、肝臟功能，提高免疫能力。

② 在改善體組成、肝臟功能方面MLE作用效果優于DNJ，而DNJ對ROS清除效果更佳；MLE的整體添加效果優于DNJ。