小肽對大黃魚仔魚生長和小腸發育的影響及其在低溫脅迫下的抗氧化應激效應

李文成 趙旭民 張延軍 宋 煒,4 曾 霖 張 惠 趙向炯

(1.浙江海洋大學國家海洋設施養殖工程技術研究中心，舟山316000；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海200090； 3.浙江華太生物科技有限公司，義烏322005；4.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，青島266237)

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國南方沿海重要海洋經濟魚類，其營養豐富、口感鮮美，備受廣大消費者的青睞[1]。自從20世紀80年代大黃魚大批量人工育苗技術獲得突破以來，其養殖業在福建、廣東、浙江等地得到了迅速發展[2]。然而，冬春季大黃魚繁殖期間，其仔稚魚死亡率高，尤其是在浙江養殖區域。低溫使魚類處于脅迫生理狀態，可能導致其生長緩慢、免疫力低下、疾病頻繁爆發[3-4]。當前，養殖戶濫用抗生素來防治和治理環境脅迫所誘導的魚類疾病，這容易引起魚類機體和水環境抗生素藥物殘留和病原菌耐藥性等問題，影響了水產品和水環境安全，并阻礙了水產養殖的綠色發展。

當魚類遭受環境脅迫時，導致活性氧(oxygen species,ROS)大量產生[5]。若機體不能有效控制ROS含量，將會產生蛋白質羰基化、脂質過氧化、DNA合成障礙等危害，從而導致魚類生理功能失常[6]。魚類可以通過抗氧化系統控制ROS過量產生，從而維持機體氧化還原平衡。環境脅迫能夠上調抗氧化酶如過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)等基因的表達[7]。非酶抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione,GSH)可與抗氧化酶協同作用，共同抑制ROS過量產生[8]。另外，魚類的非特異性免疫系統在緩解脅迫誘導的損傷方面也發揮著重要作用，且與抗氧化系統密切相關[9]。作為非特異性免疫系統的重要組成部分，溶菌酶(lysozyme,LZM)和堿性磷酸酶(alkaline phophatase,AKP)基因表達水平通常被用作評價環境脅迫、細菌感染、免疫刺激劑等作用效應的分子生物標記物[10]。

基因表達水平主要受控于核轉錄因子(nuclear transcription factors,NFs)。在哺乳動物中，NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)和核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)均能被ROS誘導激活，激活的Nrf2和NF-κB分別結合到抗氧化酶和非特異性免疫酶相關基因的順式作用元件，從而調控這些目的基因的表達[11-12]。因此，Nrf2和NF-κB分別在抗氧化反應和非特異性免疫反應中發揮重要作用。

小肽又稱為短肽、寡肽，是一類由蛋白質水解、易消化吸收且具有多種生物功能的小分子物質[13]。它能顯著提高水生動物的攝食量、飼料效率及機體蛋白質合成能力，從而促進它們的生長。小肽也能改善水生動物的抗氧化性能和非特異性免疫力，從而降低發病率和提高抗逆性。已有研究表明，飼料中添加小肽可提高魚類的抗氧化能力和非特異性免疫力[14-15]，也能改善凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的抗病力[16]。然而，有關小肽營養強化活餌料對魚類生理影響的研究尚未見報道。

本試驗用小肽營養強化輪蟲和鹵蟲投喂于大黃魚仔魚，以探討小肽對其生長和小腸發育的影響，然后將大黃魚仔魚低溫暴露24 h，以探討小肽對低溫脅迫下大黃魚仔魚抗氧化能力和非特異性免疫力的影響，該研究成果可為大黃魚仔魚養殖中小肽最佳營養強化濃度提供基礎數據，也可為小肽緩解環境脅迫對魚類損傷的研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 小肽制備

利用豬小腸生產肝素鈉的下腳料腸黏膜為原料，采用堿性水解蛋白酶和胰蛋白酶裂解制備小肽。使用凝膠色譜法測定小肽分子質量組成，分子質量小于2.0 ku的占80%以上。小肽氨基酸組成采用國家標準GB/T 18246—2000中方法測定，氮、五氧化二磷、氧化鉀和有機質采用農業行業標準NY 525—2012中方法測定，其主要成分見表1。

表1 小肽主要成分(濕重基礎)

1.1.2 輪蟲和鹵蟲營養強化

輪蟲營養強化：將寧德霞浦育苗場水泥池培育的褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)以100～120條/mL的密度轉移到5個容量為1 000 L的鋼化玻璃桶的水體(海水800 L)中，加入小肽(體積百分濃度約為86.50%)，使得水體中小肽濃度分別為0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3，在水溫為(24.1±3.4) ℃、鹽度為26.12±0.35、光照為3 000 lx的條件下進行營養強化。7 d以后，用250目尼龍篩絹網袋過濾收集10%體積的輪蟲用于大黃魚仔魚投喂，然后再加入相同濃度和體積的小肽溶液，每天4次。將小肽濃度為0和2.0 mL/m3養殖桶中所收集的輪蟲樣本(20 mL)保存于-20 ℃冰箱，取樣3次，用于粗蛋白質含量和氨基酸組成測定。

鹵蟲營養強化：將寧德霞浦育苗場孵化的鹵蟲Ⅰ齡無節幼體(體內卵黃已耗盡)按45～50 條/mL的密度放入5個容量為1 000 L的鋼化玻璃桶水體(海水800 L)中，加入小肽(體積百分濃度約為86.50%)，使得水體中小肽濃度分別為0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3，在水溫為(26.0±2.3) ℃、鹽度為26.12±0.35、自然光照的條件下營養強化24 h后，用250目尼龍篩絹網袋過濾收集鹵蟲用于大黃魚仔魚投喂。將小肽濃度為0和2.0 mL/m3養殖桶中所收集的鹵蟲樣本(20 mL)保存于-20 ℃冰箱中，取樣3次，用于粗蛋白質含量和氨基酸組成測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗1：大黃魚仔魚生長試驗

從寧德霞浦育苗場購買7.5萬尾左右剛孵化出的大黃魚仔魚，放入15個容積為300 L的鋼化玻璃桶中飼養，約5 000尾/桶。將15桶試驗魚隨機分為5組，每組3桶(重復)，采用靜水充氣養殖，每天換水2次(08:00和16:00)，換水率為60%。水質參數如下：水溫為(24.1±3.4) ℃，鹽度為26.12±0.35，pH為7.67±0.31；總氨氮濃度為(0.15±0.02) mg/L～(0.20±0.03) mg/L，各組之間無顯著差異(P>0.05)。將經0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3小肽營養強化好的輪蟲和鹵蟲按圖1的投喂策略投喂5組大黃魚仔魚，并分別命名為對照組、S0.5組、S1.0組、S2.0組和S3.0組。每天投喂4次，投喂間隔6 h。大黃魚仔魚攝食0.5 h之后剩余少量的輪蟲和鹵蟲即可停止投喂。試驗結束后，每桶隨機取10尾魚，用精度為0.1 mm的游標卡尺測量體長。每桶隨機取4尾魚，用4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)固定，用于組織切片觀察。組織切片制作具體步驟[17]如下：首先，樣品采用梯度乙醇使其脫水，水楊酸甲酯透明，石蠟包埋；然后，用石蠟切片機切成矢狀切片(厚度為4～6 μm)，并用蘇木素-伊紅(HE)染色；最后，用光學顯微鏡觀察切片，用分析軟件Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics, Inc.,美國)隨機選取5處測量小腸絨毛高度(mm)(圖2中紅色線段)，計數視野內絨毛數量并測量組織面積(mm2)，并求出單位面積內絨毛數量(個/mm2)(圖3)。

圖1 輪蟲和鹵蟲投喂策略

圖2 大黃魚仔魚小腸絨毛高度示意圖

圖3 大黃魚仔魚小腸絨毛數量和組織面積示意圖

1.2.2 試驗2：大黃魚仔魚低溫脅迫試驗

選擇21個容量為70 L的塑料桶，分為7組，每組3個桶(重復)。按圖4所示，從試驗1對應的鋼化玻璃桶中隨機取200尾魚放入塑料桶中。2組采用常溫處理，另外5組采用低溫處理，分別命名為S0常溫組、S1.0常溫組、S0低溫組、S0.5低溫組、S1.0低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組。降溫方式如下：將養殖桶水體溫度以3 ℃/h降至12 ℃(自然海水溫度)，然后將12 ℃水溫維持24 h。試驗結束后取樣，每桶取4尾試驗魚用于ROS和GSH含量測定，另取4尾試驗魚的肝臟用于基因表達測定。所有樣本先放于液氮中，然后轉移到-80 ℃超低溫冰箱中保存。

圖4 試驗組示意圖

1.3 指標測定

1.3.1 粗蛋白質含量和氨基酸組成

采用凱氏定氮法測定輪蟲和鹵蟲中粗蛋白質含量。參照國家標準GB/T 18246—2000的方法進行樣品處理，采用高效液相色譜儀測定其氨基酸組成。

1.3.2 ROS和GSH含量測定

全魚均漿液制備參照Zeng等[18]的方法。向全魚中加入9倍的4 ℃緩沖液[1 mmol/L 4-(2-氨甲基)苯磺酰氟鹽酸、1 mmol/L苯甲脒、2 mmol/L二硫蘇糖醇、5 mmol/L乙二胺四乙酸、80 mmol/L氨基丁三醇，pH 7.6)，勻漿后制成10%勻漿液。在4 ℃下以900 r/min離心10 min，取上清，采用Bradford方法測量蛋白質含量，使用試劑盒(南京建成生物工程研究所產品)采用分光光度法測定ROS和GSH含量。

1.3.3 抗氧化和非特異性免疫相關基因的實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

表2 實時熒光定量PCR引物序列

續表2基因名稱Gene names引物序列Primer sequences (5'—3')基因長度Gene length/bpPCR擴增效率PCR amplification efficiency谷胱甘肽還原酶GRF:AGCCAAAACAGCCGTGATR:CGGCTAACATAAGCATCCC1260.98NF-E2相關因子2Nrf2F:CCCTCAAAATCCCTTTCACTR:GCTACCTTGTTCTTGCCGC900.96c型溶菌酶c-type LZMF:CCAGAGCCATCAACCACAACACTR:GATCGCCACGCTGACATCATC1520.97g型溶菌酶g-type LZMF:TCAGCCAAGGCACCGACATR:GCATCCACCGCTTCATAGCA1481.04堿性磷酸酶AKPF:TCAGCAGACTCCCGTCCCTCR:GTTGTCCAGTTCGCAGTTCTCATAG1750.98核轉錄因子-κBNF-κBF:TGCGGCTCGTGCGGATAR:GCGGCTTCAACTGGACTGC1171.05β-肌動蛋白β-actinF:TCGTCGGTCGTCCCAGGCATR:ATGGCGTGGGGCAGAGCGT1821.05

1.4 數據處理與統計分析

試驗數據表示為平均值±標準誤。采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，試驗結果經單因素方差分析(one-way ANOVA)后，若存在顯著差異，再采用Duncan氏法進行多重比較。以P<0.05為差異顯著標準。

2 結果與分析

2.1 小肽對輪蟲和鹵蟲的營養強化效果

與對照組相比，S2.0組輪蟲和鹵蟲的粗蛋白質含量無顯著變化(P>0.05)(表3)。與對照組相比，S2.0組輪蟲和鹵蟲的必需氨基酸(EAA)和總氨基酸(TAA)含量顯著增加(P<0.05)，但2組之間的EAA/TAA差異不顯著(P>0.05)(表4)。

表3 小肽對輪蟲和鹵蟲粗蛋白質含量的影響(干物質基礎)

表4 小肽對輪蟲和鹵蟲氨基酸組成的影響(占粗蛋白質的百分比)

續表4氨基酸Amino acids輪蟲 Rotifers對照組Control groupS2.0組S2.0 group鹵蟲 Artemia nauplii對照組Control groupS2.0組S2.0 group甘氨酸 Gly4.37±0.295.14±0.22*3.37±0.293.64±0.25丙氨酸 Ala3.02±0.233.88±0.24*4.08±0.344.78±0.24*纈氨酸 Val2.96±0.143.73±0.21*3.12±0.243.62±0.21蛋氨酸 Met0.59±0.040.71±0.10*0.64±0.060.76±0.09異亮氨酸 Ile2.63±0.163.29±0.28*2.40±0.152.73±0.13*亮氨酸 Leu4.08±0.245.25±0.22*3.94±0.244.29±0.14酪氨酸 Tyr2.86±0.193.39±0.22*2.75±0.212.96±0.40苯丙氨酸 Phe2.71±0.143.46±0.19*1.66±0.151.81±0.19賴氨酸 Lys3.89±0.275.16±0.24*5.86±0.506.72±0.38組氨酸 His0.63±0.070.74±0.071.47±0.111.58±0.10精氨酸 Arg1.87±0.152.24±0.12*5.24±0.326.13±0.48脯氨酸 Pro3.08±0.293.68±0.19*3.36±0.193.73±0.26必需氨基酸 EAA19.20±1.1524.57±1.53*20.53±1.6723.38±1.91總氨基酸 TAA46.47±1.3357.59±1.66*58.33±1.8365.17±2.07*必需氨基酸/總氨基酸 EAA/TAA41.32±1.1642.65±1.1335.18±1.3235.71±1.35

2.2 小肽對大黃魚仔魚生長和小腸發育的影響

由圖5可知，與對照組相比，投喂由4種不同濃度小肽營養強化的輪蟲和鹵蟲均能促進大黃魚仔魚的生長，使其體長顯著增加(P<0.05)。根據小肽濃度和大黃魚仔魚體長的二元回歸分析，小肽最佳營養強化濃度為1.88 mL/m3(圖5)。與對照組相比，4種不同濃度小肽組的小腸絨毛高度均顯著增加(P<0.05)，尤其是S1.0組；S1.0組和S3.0組的小腸絨毛數量顯著增多(P<0.05)；S1.0組和S2.0組的小腸組織面積顯著增大(P<0.05)。然而，小腸單位面積內絨毛數量不受小肽濃度的顯著影響(P>0.05)(表3)。

數據柱標注不同字母表示顯著差異(P<0.05)。圖6同。

表5 小肽對大黃魚仔魚小腸絨毛形態的影響

2.3 小肽對大黃魚仔魚ROS和GSH含量的影響

由圖6可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組和S3.0低溫組的ROS含量顯著降低(P<0.05)，S0低溫組、S0.5低溫和S2.0低溫組的ROS含量顯著升高(P<0.05)。與S0常溫組相比，除S0低溫組的GSH含量顯著降低(P<0.05)外，而小肽在常溫和低溫條件下均能顯著增加大黃魚仔魚的GSH含量(P<0.05)。

圖6 小肽對低溫脅迫下大黃魚仔魚ROS(A)和GSH(B)含量的影響

2.4 小肽對大黃魚仔魚肝臟抗氧化相關基因表達水平的影響

由表6可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組的銅鋅超氧化物歧化酶(copper-zinc superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶-1a(glutathione peroxidase-1a,GPx-1a)、谷胱甘肽過氧化物酶-1b(glutathione peroxidase-1b，GPx-1b)、GR和Nrf2基因表達水平均顯著增加(P<0.05)；S0低溫組的Cu/Zn-SOD、CAT、GPx-1a、GR和Nrf2基因表達水平顯著降低(P<0.05)；S0.5低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR和Nrf2基因表達水平均顯著提高(P<0.05)；S1.0低溫組的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GR和Nrf2基因表達水平均顯著提高(P<0.05)。

2.5 小肽對大黃魚仔魚肝臟非特異性免疫相關基因表達水平的影響

由表7可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組的c型溶菌酶(c-type lysozyme，c-typeLZM)、g型蛋白溶菌酶(g-type lysozyme，g-typeLZM)、AKP和NF-κB基因表達水平無顯著變化(P>0.05)；S0低溫組的c-typeLZM、g-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達水平顯著降低(P<0.05)；S1.0低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組的c-typeLZM、g-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達水平顯著提高(P<0.05)；S0.5低溫組的c-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達水平顯著增加(P<0.05)。

表6 小肽對低溫脅迫下大黃魚仔魚肝臟抗氧化相關基因表達水平的影響

表7 小肽對低溫脅迫下大黃魚仔魚肝臟非特異性免疫相關基因表達水平的影響

2.6 相關性分析

由表8可知，大黃魚仔魚ROS含量與Nrf2和NF-κB基因表達水平呈顯著負相關(P<0.05)；Nrf2基因表達水平與抗氧化酶(Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR)基因表達水平呈顯著正相關(P<0.05)；NF-κB基因水平與非特異免疫酶(c-typeLZM、g-typeLZM、AKP)基因表達水平呈顯著正相關(P<0.05)。

表8 大黃魚仔魚不同參數之間的相關性分析

3 討 論

輪蟲和鹵蟲是海水仔魚育苗的主要活性餌料。然而，它們均存在營養缺陷，需要進行營養強化才適合充當開口餌料。粗蛋白質含量、氨基酸種類及其含量是重要的營養指標。在本研究中，盡管水體中小肽濃度為2.0 mL/m3時對輪蟲和鹵蟲的粗蛋白質含量未產生顯著影響，但能顯著提高它們的EAA和TAA含量，表明小肽改善了輪蟲和鹵蟲的營養價值。

抗氧化系統和免疫系統在保護機體免受環境脅迫所造成的損傷等方面發揮著積極作用[21]。當前，關于低溫脅迫對魚類影響的分子機理研究僅有少量報道。有研究表明，飼料中的小肽能夠通過改善魚類的抗氧化性能和非特異性免疫力來提高脅迫耐受性[15-16]。本試驗研究了小肽營養強化輪蟲和鹵蟲對大黃魚仔魚生長的影響以及對低溫脅迫下大黃魚仔魚抗氧化性能和非特異性免疫力的影響，并試圖闡明其分子機理。

與對照組相比，不同濃度小肽營養強化輪蟲和鹵蟲均顯著提高了大黃魚仔魚的體長、小腸絨毛高度和組織面積等生長發育指標，尤其是S1.0組，與李杰[22]的研究結果相似。小肽通過增加小腸絨毛高度、數量和組織面積來增加小肽載體數量，從而改善游離氨基酸和小肽的轉運能力，進而提高魚類機體內的蛋白質合成能力和沉淀量，最終促進魚類的生長[23]。以大黃魚仔魚體長為參數，小肽最佳營養強化濃度為1.88 mL/m3。

當魚類處于氧化應激生理狀態時，機體內通常會產生大量ROS，因此ROS被認為是氧化應激標志物[24]。S0低溫組的大黃魚仔魚ROS含量較S0常溫組顯著提高，表明低溫對大黃魚仔魚產生了氧化損傷。與S0常溫組相比，小肽能夠顯著降低大黃魚仔魚機體內的ROS含量，表明其抗氧化能力發生了改變，從而使機體內的氧化還原反應產生了新的平衡[5]。與S0低溫組相比，小肽能夠顯著降低低溫脅迫下大黃魚仔魚機體內的ROS產量，表明小肽能夠緩解低溫脅迫誘導的氧化損傷。非酶抗氧化劑GSH在抑制超氧化物產生、緩解氧化應激反應等方面發揮著重要作用[8]。與S0常溫組相比，小肽增加了大黃魚仔魚機體內的GSH含量。這進一步解釋了小肽能夠提高大黃魚仔魚在低溫脅迫下的抗氧化能力，從而降低ROS含量，緩解氧化損傷。

與S0常溫組相比，低溫脅迫(S0低溫組)顯著抑制大黃魚仔魚肝臟非特異性免疫酶(c-typeLZM、g-typeLZM和AKP)基因表達水平，從而降低了非特異性免疫力；而小肽提高了低溫脅迫下大黃魚仔魚肝臟c-typeLZM、g-typeLZM和AKP基因表達水平，從而提高了非特異性免疫力，以此來應對低溫脅迫誘導的損傷。值得注意的是，在常溫條件下，大黃魚仔魚肝臟非特異性免疫相關基因表達水平不受小肽(S1.0常溫組)的影響。有研究表明，功能性食品可改善能量代謝效率來改變魚類宿主生理狀態。一旦遭受脅迫時，魚類即可通過改善免疫功能來保護機體免遭脅迫誘導的氧化損傷[30]。另外，當魚類處于正常生理狀態時，非特異性免疫相關基因的過量表達也會對宿主產生負面影響[31]。

基因表達水平受核轉錄因子的調控，核轉錄因子Nrf2和NF-κB分別在調控抗氧化反應和非特異性免疫反應過程中發揮重要作用[12,32]。本研究中，低溫脅迫抑制了大黃魚仔魚肝臟Nrf2和NF-κB基因的表達，這與汞脅迫狀態下大黃魚的研究結果[30-32]相似。Nrf2基因表達水平與Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR基因表達水平呈顯著正相關，表明這些抗氧化酶基因表達受Nrf2調控。NF-κB基因表達水平與c-typeLZM、g-typeLZM和AKP基因表達水平呈顯著正相關，表明這些非特異性免疫酶基因表達的激活依賴于NF-κB信號通路。ROS可充當抗氧化反應和非特異性免疫反應的第二信號分子。ROS可激活Nrf2和NF-κB基因表達，從而調控抗氧化酶基因和非特異性免疫酶基因的表達[33-34]。ROS含量與Nrf2和NF-κB基因表達水平呈顯著負相關驗證了這一觀點。

4 結 論

① 小肽能夠提高輪蟲和鹵蟲的必需氨基酸和總氨基酸含量，從而促進大黃魚仔魚的生長和小腸發育，最佳營養強化濃度為1.88 mL/m3。

② 小肽通過誘導核轉錄基因Nrf2和NF-κB的表達來增加抗氧化酶基因和非特異性免疫酶基因表達水平，從而緩解低溫脅迫誘導的氧化損傷。

致謝：

感謝臺州大陳黃魚有限公司陳國業工程師對大黃魚仔魚養殖所提供的寶貴意見和技術指導。