槲皮素對豬腸上皮細胞利用蛋白質的作用機制

姚佳穎 毛彥軍 王杉杉 盧 涵 王 博 應琳琳 李 垚

(東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱150030)

飼料蛋白質利用率低已成為世界各國養豬業普遍存在的問題，不僅浪費蛋白質資源，還會因為過多氮排泄造成環境污染，添加飼料添加劑是提高飼料蛋白質利用的有效措施之一。本課題組前期研究證明，沙棘黃酮可提高肉雞和蛋雞蛋白質利用率[1]，同時發現提高肉雞蛋白質利用率與槲皮素激活雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)信號通路有關[2]。而槲皮素是沙棘黃酮的主要成分，具有抗菌、消炎、抗病毒、抗氧化、免疫調節等多種活性[3-5]。此外，槲皮素還可以促進畜禽對其他營養物質的利用[2,6-7]，這些結果均表明，飼糧添加黃酮類化合物是提高飼料蛋白質利用率的有效途徑。然而關于槲皮素影響飼料蛋白質利用的機制研究尚不完善，特別是槲皮素對豬利用飼料蛋白質的作用機制研究仍屬空白。因此，本研究以豬腸上皮細胞作為模型，研究槲皮素對豬腸上皮細胞利用蛋白質的作用機制，旨在為槲皮素在養豬生產中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器及材料

ELITE-300PLUS型基礎電泳儀電源(美國Wealtec)；5415C型高速冷凍離心機(德國Eppendorf)；UV-2540分光光度計(日本SHIMAZDU)；NanoDrop超微量紫外-可見光分光光度計(美國ThermoFisher)；Yrdimes SW07D0567蛋白印跡儀(美國Wealtec)；Li-COR Odyssey凝膠成像分析系統(美國Li-COR)；ABI Prism 7500型實時熒光定量PCR儀(德國Roche)。

豬腸上皮細胞由中國科學院亞熱帶生態研究所印遇龍院士惠贈；DMEM/F12培養液購自Invitrogen公司；無支原體胎牛血清購自Gibco公司；槲皮素(純度≥97%)、二甲基亞砜(DMSO)、雙抗、磷酸鹽緩沖液(PBS)皆購自美國Sigma公司；反轉錄試劑盒與熒光定量試劑盒皆購自中國大連TaKaRa公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳試劑盒、全蛋白抽提試劑盒和Western blot檢測試劑盒皆購自中國南京凱基生物科技發展有限公司；其他相關試驗試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養

將復蘇后的豬腸上皮細胞按1×105個/瓶接種于含有89% DMEM/F12、10%胎原血清和1%雙抗培養液的25 mL培養瓶中，之后將細胞培養瓶置于二氧化碳恒溫密閉式培養箱(37 ℃，飽和濕度、體積分數為5%)中進行連續傳代培養。培養液每隔2 d更換1次，以確保細胞維持對數生長。收集對數生長期的細胞并消化分離后，按1×106個/mL的濃度以每孔2 mL接種到6孔板。將經過48 h培養的細胞分為6組，試驗組分別添加含0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L槲皮素的DMSO溶液，對照組添加0.2% DMSO，每組重復6孔。處理72 h后收集細胞以進行RNA的提取和蛋白質含量的測定。

1.2.2 蛋白質含量的測定

槲皮素處理72 h后，棄掉培養液并用PBS溶液清洗待測細胞2次。每孔加入200 μL放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，離心(10 000 r/min，3 min)后取上清液。采用二喹啉甲酸(BSA)法，按照牛血清白蛋白試劑盒的說明制作標準曲線。將待測樣品與工作液按100 μL/孔先后加入96孔板中，每個樣品平行3次。立即混勻，于37 ℃水浴60 min后再冷卻至室溫，然后用酶標儀在562 nm處測定樣品的吸光度，并根據標準曲線計算出樣品的蛋白質含量。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測

試驗使用Trizol試劑提取受試細胞的總RNA，并用NanoDrop超微量紫外-可見光分光光度計測定提取的總RNA濃度和A260 nm/A280 nm的比值。RNA的完整性用1.2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測，確保出現5S、18S和28S rRNA這3條亮帶。用0.1%焦碳酸二乙酯水調整所有樣品的RNA濃度至200 ng/μL。按照反轉錄試劑盒說明將樣品總RNA反轉錄為模板cDNA。使用ABI 7500熒光定量PCR儀和熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測。內參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，試驗采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。上海生工生物工程股份有限公司設計并合成所有引物，引物序列見表1和表2。

1.2.4 Western blot檢測

用冰冷PBS溶液清洗細胞2次后移至預冷的離心管中，于冰上加入含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟(PMSF)混合物的冰冷裂解緩沖液。樣品在4 ℃搖床振蕩15 min后，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取得上清液即為全蛋白抽提物。取30 μg蛋白質樣品，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉移至硝酸纖維素(NC)膜，將膜置于平皿中，5%脫脂奶粉封閉液進行封閉，封閉結束后用Tris-HCl緩沖液(TBST)清洗3次。將膜移至含有一抗的平皿中，置于4 ℃搖床振蕩孵育過夜。次日，棄去一抗，經TBST清洗后加入用封閉液按1∶8 000比例稀釋的二抗，室溫振蕩反應2 h，結束后用TBST清洗3次，按照電子化學發光法(ECL)試劑盒的說明書進行檢測。GAPDH為內參。

1.3 數據統計分析

試驗數據的單因素方差分析與Duncan氏多重比較檢驗由SPSS 20.0軟件完成。Western blot檢測結果的灰度分析使用Gel-Pro Analyzer 4軟件完成，GraphPad Prism 5軟件完成試驗結果的柱狀圖繪制。試驗結果用平均值±標準誤表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

表1 氨基酸和小肽轉運載體引物序列

表2 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路相關信號分子的引物序列

2 結果與分析

2.1 槲皮素對豬腸上皮細胞蛋白質含量的影響

由表3可知，與對照組相比，0.4和0.8 mg/L槲皮素均極顯著增加豬腸上皮細胞中蛋白質的含量(P<0.01)。

2.2 槲皮素對豬腸上皮細胞氨基酸和小肽轉運載體mRNA相對表達量的影響

由表4可知，與對照組相比，1.6 mg/L槲皮素極顯著提高細胞中興奮性氨基酸轉運載體1(EAAC1)、谷氨酰胺載體2(ASCT2)、氨基酸轉運載體A2(ATA2)、L型氨基酸轉運載體2(LAT2)、酸轉運載體1(CAT1)、b0,+系統氨基酸轉運載體(rBAT)、y+L系統氨基酸轉運載體1(y+LAT1)、y+L系統氨基酸轉運載體2(y+LAT2)和寡肽轉運載體1(PepT1)mRNA相對表達量(P<0.01)。

2.3 槲皮素對豬腸上皮細胞mTOR信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

由表5可知，與對照組相比，0.4 mg/L槲皮素極顯著降低結節性硬化復合物1(TSC1)和真核細胞翻譯起始因子4A(eIF4A)mRNA相對表達量(P<0.01)；0.8 mg/L可極顯著增加豬腸上皮細胞mTOR和核糖體蛋白S6(RPS6)mRNA相對表達量并極顯著降低TSC1 mRNA相對表達量(P<0.01)；1.6 mg/L槲皮素極顯著增加豬腸上皮細胞中mTOR、真核起始因子4E結合蛋白1(4E-BP1)、真核細胞翻譯起始因子4E(eIF4E)、eIF4A、真核細胞翻譯起始因子4B(eIF4B)和RPS6 mRNA相對表達量(P<0.01)。

表3 槲皮素對豬腸上皮細胞蛋白質含量的影響

表4 槲皮素對豬腸上皮細胞氨基酸和小肽轉運載體mRNA相對表達量的影響

續表4項目Items槲皮素添加水平 Quercetin supplemental levels/(mg/L)0(對照 Control)0.10.20.40.81.6中性和堿性氨基酸載體b0,+系統氨基酸轉運載體rBAT1.05±0.05Aa1.11±0.19Aa1.48±0.44Aa1.15±0.02Aa1.20±0.08Aa2.22±0.10Bby+L系統氨基酸轉運載體1y+LAT11.16±0.09Aa0.60±0.04Bb0.77±0.10Bb0.64±0.04Bb0.59±0.11Bb2.08±0.20Ccy+L系統氨基酸轉運載體2y+LAT21.06±0.17Aa0.55±0.05Bb0.69±0.05Bb0.52±0.03Bb0.58±0.06Bb1.31±0.08Aa小肽轉運載體寡肽轉運載體1PepT11.11±0.15Aa0.89±0.07ABab0.54±0.05Bb0.49±0.06Bb0.77±0.05Aa1.47±0.30Cc

表5 槲皮素對豬腸上皮細胞mTOR信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

為驗證槲皮素處理對豬腸上皮細胞mTOR信號通路相關基因表達的影響，采用Western blot法檢測mTOR、eIF4E、4E-BP1和eIF4A蛋白表達量。此外，根據槲皮素處理后細胞中mTOR信號通路相關基因的mRNA相對表達量結果，選擇0.1和1.6 mg/L槲皮素進行檢測。由圖1可知，與對照組相比，0.1和1.6 mg/L槲皮素可極顯著提高細胞中mTOR、eIF4E和eIF4A蛋白表達量(P<0.01)，并極顯著降低4E-BP1蛋白表達量(P<0.01)。

3 討 論

3.1 槲皮素對豬腸上皮細胞蛋白質含量的影響

蛋白質是構成動物機體的關鍵物質，在機體的各項生命活動中都發揮重要作用。目前，蛋白質資源短缺和過量的氮排泄問題使得提高畜禽對蛋白質的利用變得更加迫切。開發更加有效的飼料添加劑如黃酮類物質，是解決這一問題的好辦法。飼糧添加大豆黃酮和柑橘黃酮可以提高肉雞胸肌蛋白質含量[8]。富含黃酮類物質的銀杏葉提取物和連翹提取物提高了愛拔益加肉雞的粗蛋白質表觀代謝率[9-10]。本課題組前期研究發現，槲皮素可以提高愛拔益加肉雞的粗蛋白質表觀代謝率并增加胸肌、腿肌蛋白質沉積，這可能與槲皮素提高了肉雞消化道蛋白酶的活性及激活TOR信號通路有關[2]。本試驗發現，槲皮素提高了豬腸上皮細胞中蛋白質含量，提示槲皮素可能與其他黃酮類物質相同，也具有提高畜禽對蛋白質利用率的作用。

mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin;4E-BP1:真核起始因子4E結合蛋白1 eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1;eIF4E:真核細胞翻譯起始因子4E eukaryotic translation initiation factor 4E; eIF4A：真核細胞翻譯起始因子4A eukaryotic translation initiation factor 4A;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。

3.2 槲皮素對豬腸上皮細胞氨基酸和小肽轉運載體mRNA相對表達量的影響

氨基酸轉運載體在感應機體腸腔中氨基酸的流動、調節游離氨基酸穿過腸細胞頂端和刷狀緣膜的運動、以及細胞內氨基酸池和下游信號中起著不可或缺的作用[11-12]。依據氨基酸的底物特異性將氨基酸轉運載體分為中性系統、堿性系統、酸性系統、亞胺-甘氨酸系統和β-氨基酸系統[12-13]。轉運載體的基因表達可作為小腸生長和吸收能力的指標[12,14-15]。EAAC1是一種對谷氨酸具有高親和力的鈉依賴性氨基酸轉運載體[16]，當斷奶仔豬回腸EAAC1基因表達降低時，回腸谷氨酸含量相應降低[17]。ATA2、ASCT2和LAT2是中性氨基酸轉運載體，在腸腔內，ASCT2可吸收丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、蘇氨酸、絲氨酸與谷氨酰胺等大部分的中性氨基酸；ATA2對部分中性氨基酸有廣泛的親和力，能夠吸收蛋氨酸、脯氨酸、絲氨酸等中性氨基酸；而LAT2主要對芳香族氨基酸和支鏈氨基酸進行轉運。CAT1屬于堿性氨基酸轉運載體，能夠轉運鳥氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸。rBAT、y+LAT1和y+LAT2對中性氨基酸和堿性氨基酸具有廣泛的親和力。小肽與氨基酸的吸收機制不同，兩者相互獨立，互不干擾，因此，小肽能夠降低常見吸收位點針對游離氨基酸競爭吸收的拮抗作用以加速氨基酸吸收與蛋白質合成[18]。PepT1主要在腸上皮細胞表達，是腸上皮細胞吸收小肽的主要載體，能夠將具有2～5個氨基酸殘基的小肽轉運到腸腔內，而且轉運二肽的速度最快[19]。黃酮類物質雖能促進氨基酸的吸收[20]，但對氨基酸及小肽轉運載體作用的研究卻鮮見報道。在本研究中，槲皮素促進了豬腸上皮細胞中氨基酸轉運載體EAAC1、ASCT2、ATA2、LAT2、CAT1、rBAT、y+LAT1、y+LAT2和小肽轉運載體PepT1 mRNA相對表達量，表明槲皮素能經由上調氨基酸及小肽轉運載體的表達來增強豬腸上皮細胞對氨基酸和小肽的吸收。

3.3 槲皮素對豬腸上皮細胞mTOR信號通路相關基因mRNA相對表達量及蛋白表達量的影響

氨基酸、能量和生長因子能夠有效激活mTOR信號通路[21]，mTOR信號通路的靶點可調節腸上皮細胞中的氨基酸轉運蛋白，促進氨基酸的吸收和利用，還可通過調控腸上皮細胞中的氨基酸轉運載體參與調節氨基酸的吸收和利用[22-23]。S6K1和4E-BP1是mTOR信號通路下游最重要的2個信號分子。正常情況下，mTOR信號通路可通過調節S6K1和4E-BP1等下游信號通路蛋白的磷酸化狀態傳遞機體營養狀況等信號，進而調控細胞內核糖體發生、蛋白質合成等過程[24]。研究發現，甘氨酸能夠通過調控mTOR信號通路來促進新生豬腸上皮細胞的生長和增殖[25]；谷氨酰胺可激活豬小腸細胞mTOR信號通路并調控S6K1和4E-BP1表達以增加細胞內蛋白質合成且抑制蛋白質降解[26]。mTOR信號通路能夠調節4E-BP1的磷酸化水平以影響翻譯起始復合物的功能。TSC是mTOR復合物的重要上游調節因子。若TSC1/2二聚體的磷酸化被激活，則mTOR復合物1(mTORC1)的活性被抑制；當TSC1/2二聚體的磷酸化被抑制時，mTORC1的活性被增強，因此通路的信號被傳遞到下游[27]。本研究中，槲皮素降低了TSC1 mRNA相對表達量，意味著槲皮素處理可能導致TSC1蛋白被翻譯的數量減少，從而抑制TSC1/2二聚體的磷酸化，使得mTORC1活性增強，有利于信號傳至下游。mTORC1被激活后，4E-BP1被磷酸化并與eIF4E分離[28]。隨著游離eIF4E的增加，可與eIF4A和eIF4G合成eIF4F復合物，促進帽依賴式翻譯。在本研究中，槲皮素上調了4E-BP1 mRNA相對表達量，這意味著槲皮素處理可能導致更多的4E-BP1蛋白被翻譯；此外，槲皮素降低了非磷酸化4E-BP1蛋白的表達，提示槲皮素增加了磷酸化4E-BP1蛋白的表達，從而增加了游離eIF4E的數量；而且本研究中，槲皮素增加了eIF4EmRNA相對表達量和蛋白表達量，進一步說明槲皮素通過調節4E-BP1的磷酸化狀態促進帽依賴式翻譯過程。mTOR信號通路還能夠通過調節S6K1的磷酸化水平調控核糖體蛋白和翻譯調節蛋白的合成以及蛋白質翻譯過程中肽鏈的延伸[2]。活化的S6K1可促進eIF4B的磷酸化，并通過eIF4G和eIF4A形成eIF4F復合物，從而促進帽依賴式翻譯。真核細胞延伸因子2激酶(eEF2K)能夠促進真核細胞延伸因子2(eEF2)磷酸化來弱化eEF2與和核糖體的結合，從而阻礙肽鏈的延伸。然而活化后的S6K1可抑制eEF2K的表達以實現促進細胞內蛋白質翻譯過程中肽鏈延伸的目的。此外，當eEF2K活性被抑制時，核糖體蛋白RPS6的磷酸化增強，繼而促進一些末端嘧啶基因的翻譯，從而影響蛋白質的翻譯過程。本研究中，槲皮素提高了豬腸上皮細胞mTOR、4E-BP1、RPS6、eIF4E、eIF4B和eIF4AmRNA相對表達量，并降低了TSC1 mRNA相對表達量。此外，槲皮素還降低了4E-BP1蛋白表達量，并提高了eIF4E、eIF4B和eIF4A蛋白表達量。本課題組以往的研究發現，槲皮素還可上調S6K1和eEF2 mRNA相對表達量，并下調eEF2KmRNA相對表達量[4]。由此可見，槲皮素可通過激活mTOR信號通路并調節部分信號通路基因的表達來促進豬腸上皮細胞對蛋白質的利用。

4 結 論

① 經槲皮素處理過的豬腸上皮細胞中蛋白質的含量提高。

② 槲皮素促進了豬腸上皮細胞氨基酸和小肽轉運載體基因的mRNA表達。

③ 槲皮素可調控豬腸上皮細胞mTOR信號通路部分基因的mRNA及蛋白表達。