枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道發育、腸道菌群和Wnt信號通路相關基因表達的影響

郭聰聰 李艷茹 耿 萌 蓋塞倫 張滕勛 齊 威 李中媛 宋亞囝 羅學剛 張同存 王 楠*

(1.天津科技大學生物工程學院，教育部工業發酵微生物學重點實驗室，天津300457；2.天津市微生物代謝與發酵過程控制工程研究中心，天津300457)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，屬于芽孢桿菌屬，能夠耐高溫、耐擠壓、耐酸堿、耐胃腸道中各種酶，從而有效地定植于腸道內，消耗腸道環境中的游離氧，造成厭氧環境，對動物生長和健康產生積極影響[1-2]。哺乳動物及禽類出生后的早期階段是腸道菌群定植的關鍵時期，對早期生長和腸道發育有重要作用[3]。目前對枯草芽孢桿菌的研究大多集中在其對斷奶后動物的生長性能、腸道發育及腸道微環境的研究，對于斷奶之前腸道菌群的定植以及作用機制的研究相對較少。因此，研究枯草芽孢桿菌對動物早期的生長、腸道發育和功能成熟、腸道菌群的影響及潛在的作用機制具有重要意義，可為今后的動物生產中由液體母乳喂養轉變為適口性較差的固體飼糧添加劑中科學、安全、有效地使用枯草芽孢桿菌提供理論依據。研究表明，25日齡仔豬飼糧中添加枯草芽孢桿菌WEI-62可以提高其生長性能，改善腸道形態結構，降低料重比，調控腸道菌群結構[4]。枯草芽孢桿菌PB6對7日齡宮內生長遲緩的仔豬的生長、腸道發育和屏障功能、消化功能以及免疫功能有一定的改善作用[5]。補充枯草芽孢桿菌DSM32315可以改善42日齡肉仔雞的生長性能和腸道結構，提高肉仔雞的平均體重和平均日增重，提高回腸絨毛長度和絨毛長度/隱窩深度[6]。Li等[7]發現，從藏牦牛中分離的枯草芽孢桿菌18能提高15日齡小鼠的平均日增重和飼料轉化率，改善黏膜形態。

Wnt信號通路的激活是腸上皮細胞分化和干細胞穩態維持所必需的[8]。研究發現，乳酸菌能夠刺激基質細胞和潘氏細胞分泌Wnt3配體，之后通過Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)途徑促進腸道干細胞的增殖和腸上皮細胞的發育[9]。由此可見，益生菌可能對Wnt信號的激活產生一定的影響，從而調控腸道干細胞的增殖和分化。而枯草芽孢桿菌是否能夠影響腸道干細胞的增殖和分化，是否能激活Wnt信號通路目前尚未見相關報道。本實驗室前期從健康新生兒糞便中分離到1株枯草芽孢桿菌RZ001，證實其能夠在小鼠的腸道內定植、增強腸黏膜屏障功能、改善葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導的結腸炎[10]。但是枯草芽孢桿菌RZ001是否影響動物的早期生長發育、腸道菌群及其作用機制尚需進一步研究。因此，本試驗選用剛出生的小鼠乳鼠，旨在研究枯草芽孢桿菌對乳鼠的早期生長、腸道發育和功能成熟、腸道菌群及Wnt信號通路相關基因表達的影響，從而揭示枯草芽孢桿菌影響動物早期腸道發育、功能成熟和腸道菌群的潛在作用機制，為今后動物飼料添加劑中科學、有效地使用枯草芽孢桿菌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、動物、細胞、試劑和儀器

1.1.1 菌種、動物、細胞

枯草芽孢桿菌RZ001分離自健康新生兒糞便，經16S rDNA測序為枯草芽孢桿菌(GenBank登錄號: NC 000964)，并保藏于中國微生物菌種保藏中心(保藏編號：CGMCC 17116)。

雄性和雌性無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠(8周齡)購買于中國軍事醫學科學院實驗動物中心(北京)。小鼠在控制條件(25 ℃、55%濕度、12 h光/暗循環)下自由采食基礎飼糧，充分飲水，每2 d更換1次鼠料和墊料。所有動物試驗均按照天津科技大學試驗動物福利倫理委員會批準的方案進行。

人結腸癌細胞HT-29(ATCC HTB-38)由本實驗室保藏。使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養，24 h后換液，以后每2～3 d更換1次培養液。細胞長滿后，用2.5 g/L胰酶消化后傳代。

1.1.2 試劑

DMEM/F12培養基，美國Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程公司；M-MLV逆轉錄酶、Trizol試劑，北京索萊寶科技有限公司；SYBR Green qPCR Master mix，DBI Bioscience公司；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、兔抗人β-catenin一抗，美國Santa Cruz公司；IRDye-800標記山羊抗小鼠二抗、IRDye-680標記山羊抗兔二抗，美國Li-COR公司；小鼠黏蛋白2(mucin 2，MUC2)檢測試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 儀器

多功能酶標儀，美國Thermo公司；轉膜儀，美國Bio-Rad公司；Odyssey紅外激光成像系統，美國LI-COR公司；Stepone Plus實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；DG-250厭氧培養箱，英國Don Whitley Scientifi(DWS)公司；正置熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2 試驗設計

在準備試驗階段，將來自同一窩產的2只雌性小鼠、1只雄性小鼠置于同一籠中，直至分娩前1～3 d。產下的乳鼠由雌性小鼠自由喂養。正式試驗階段，從新出生的乳鼠中選擇4窩窩仔數量相同的乳鼠，并將它們分為2個組(試驗組和對照組)，每組2個重復。從出生后第2天開始，試驗組乳鼠連續14 d灌胃10 μL枯草芽孢桿菌RZ001(1×107CFU/d)，對照組乳鼠連續14 d灌胃10 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3 樣品采集

每天記錄乳鼠體重。出生后第16天頸椎脫臼處死乳鼠，取肝臟、腎臟、脾臟、胸腺稱重，計算器官指數：

器官指數(%)=(器官重量/體重)×100。

迅速剪取小腸組織回腸段約2 cm，用生理鹽水沖洗干凈后在4%多聚甲醛溶液中固定，之后進行蘇木精-伊紅(HE)染色和阿利新藍-過碘酸-雪夫(AB-PAS)染色。剩余小腸組織分段放于離心管中，液氮中速凍后置于-80 ℃冷凍保藏用于后續試驗檢測。取下整個盲腸，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱中保存，用于測定盲腸內容物中微生物組成。

1.4 HE染色測定腸道黏膜形態

將多聚甲醛溶液中固定的小腸段取出，流水沖洗，進行梯度無水乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)、展片、烤片，進行HE染色。將帶有小腸組織的載玻片在二甲苯溶液中脫蠟，梯度無水乙醇復水，蘇木精染色，伊紅復染，梯度無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。所有標本均在正置顯微鏡下觀察并拍照記錄。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行數據分析，每組選取5張切片，每張切片計數4個視野中的絨毛個數，并取平均值，計算絨毛密度；每張切片選取6～8根絨毛和隱窩測量腸絨毛長度及隱窩深度，計算平均值，并計算絨毛長度/隱窩深度。

1.5 AB-PAS染色測定腸道組織杯狀細胞數量

將帶有小腸組織的常規石蠟切片脫蠟至水，阿利新藍染色液染色20 min，蒸餾水洗，過碘酸溶液氧化5 min，水洗，Schiff染色液浸染20 min，水洗10 min，可選用蘇木素染色液染核1～2 min，分化、返藍、水洗，逐級無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。染色結果為杯狀細胞呈藍色(含酸性黏蛋白)、深紅/紅紫色(含中性黏蛋白)及深淺不同的紫色(同時含酸性和中性黏蛋白)。所有切片在正置熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行杯狀細胞計數，每組選取5張AB-PAS染色的石蠟切片，每張切片隨機取4個視野，統計杯狀細胞的數目，對計數結果進行統計學分析。

1.6 實時熒光定量PCR測定基因mRNA相對表達量

小腸組織經液氮研磨之后采用Trizol法提取總RNA，并用M-MLV逆轉錄酶將RNA逆轉錄成2 μg cDNA，逆轉錄體系為25 μL。實時熒光定量PCR檢測目的基因mRNA相對表達量。PCR擴增體系20 μL：qPCR master mix 10 μL，50×ROX 0.4 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，無菌蒸餾水7.6 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，40個循環；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s繪制熔解曲線。以GAPDH作為參考基因，2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。目的基因的引物序列見表1。

1.7 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定MUC2含量

將小腸組織樣品從-80 ℃冰箱中取出平衡至室溫，按1∶10(質量∶體積)的比例加入無菌pH 7.2的1×PBS，在4 ℃下用組織勻漿器破碎成粉末，于4 ℃、2 000 r/min離心20 min，取上清液，檢測MUC2含量。檢測方法按照試劑盒說明書進行。具體操作如下：在96孔板中加入100 μL待測組織樣本或標準品，37 ℃溫育2 h；棄掉液體，加入生物素標記抗體工作液100 μL，37 ℃溫育1 h；棄掉液體洗板之后，每孔加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μL，37 ℃溫育1 h；棄掉液體洗板并加入90 μL反應底物，37 ℃避光顯色30 min之后加入50 μL終止液終止反應，在450 nm波長測定光密度值。根據標準品繪制標準曲線并計算樣本中MUC2含量。

表1 基因的引物序列

1.8 蛋白免疫印跡(Western blotting)法測定β-catenin蛋白相對表達量

枯草芽孢桿菌RZ001條件培養基的制備按文獻[10]進行。將保存在-80 ℃冰箱中的枯草芽孢桿菌RZ001常溫下解凍，按2%接種量接種于LB液體培養基中，37 ℃培養12 h進行活化，經過2次活化，終接菌于100 mL培養基中，同時以100 mL空白培養基為對照組，12 h后離心，取上清液，50 ℃旋蒸1.5 h左右，倒入玻璃培養皿中，放入-80 ℃冰箱24 h，于凍干機中凍干處理。凍干樣品重懸于細胞培養基中。

HT-29細胞以1×104mL/個的密度均勻鋪種在6孔板中培養2 d，加入5 mg/mL制備的枯草芽孢桿菌RZ001條件性培養基處理24 h后，收集總蛋白。蛋白進十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后轉移到硝化纖維素膜上，浸入封閉液中封閉1 h。分別加稀釋后的β-catenin一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶3 000)，在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下分別用山羊抗兔(1∶10 000)和山羊抗鼠(1∶10 000)二抗避光孵育1.5 h，利用Odyssey紅外激光成像系統掃膜，用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.9 實時熒光定量PCR測定盲腸微生物種群豐度

將盲腸內容物從-80 ℃冰箱中取出在冰上解凍，利用糞便基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。按照文獻[11]中報導的腸道微生物種群相對豐度檢測方法，利用實時熒光定量PCR測定腸道組織樣本中擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)在總菌中所占的比例。PCR反應條件以及反應體系與測定目的基因mRNA水平表達條件相同。所用的引物序列參考文獻[12-14]，細菌種群的引物序列見表2。測定結果通過2-ΔΔCt法計算，與細菌總16S rDNA進行比較，數值顯示為細菌總16S rDNA的相對豐度。

1.10 數據處理與分析

試驗數據使用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計及差異性分析。采用t檢驗比較2組間的統計學差異，數據以平均值±標準差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表2 細菌種群的引物序列

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠體重和器官指數的影響

如圖1所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠從出生后第2天到第8天體重顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)。如表3和表4所示，與對照組相比，試驗組的脾臟、腎臟、胸腺重量和指數顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)，但肝臟重量和指數無顯著差異(P>0.05)。以上數據表明，枯草芽孢桿菌RZ001可以促進乳鼠的早期生長，但對后期的體重增加無顯著影響。

“A”表示與對照組差異極顯著(P<0.01)，“a”表示與對照組差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸黏膜形態的影響

如圖2所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸上皮細胞微絨毛長短一致、排列整齊且更加致密。此外，如表5所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠絨毛密度和絨毛長度均顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)，隱窩深度極顯著降低(P<0.01)，絨毛長度/隱窩深度極顯著增加(P<0.01)。以上數據表明，枯草芽孢桿菌RZ001可以改變乳鼠小腸黏膜形態結構。

2.3 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道黏膜屏障、緊密連接形成的影響

如圖3所示，AB-PAS染色結果表明，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸杯狀細胞數量明顯較多；數據統計結果表明，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸杯狀細胞的數量顯著增加(P<0.05)。

如圖4所示，利用實時熒光定量PCR和ELISA方法觀察到試驗組的乳鼠小腸中MUC2的mRNA相對表達量和MUC2含量均較對照組顯著增加(P<0.05)。

如圖5所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸中緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)、閉鎖蛋白(occludin，Ocln)、封閉蛋白-3(claudin-3，Cldn-3)的mRNA相對表達量均極顯著增加(P<0.01)。

以上數據表明，枯草芽孢桿菌RZ001能夠促進乳鼠腸黏膜屏障的完整以及緊密連接的形成，從而促進腸道屏障功能的成熟。

表4 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠器官指數的影響

圖2 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸黏膜形態結構的影響(HE染色)

2.4 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠Wnt信號通路相關蛋白mRNA相對表達量的影響

如圖6所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠Wnt3、卷曲受體蛋白7(frizzled 7，Fzd7)、低密度脂蛋白受體相關蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein 5，Lrp5)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，Gsk-3β)、Ctnnb1、細胞性骨髓細胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，C-myc)、軸蛋白抑制蛋白2(Axin2)和無張力同系物1(atonal homolog 1，Atoh1)的mRNA相對表達量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，但低密度脂蛋白受體相關蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein 6，Lrp6)的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。此外，與對照組相比，試驗組的乳鼠腸道干細胞(intestinal stem cells，ISCs)標記物富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5(leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5)和Ki67的mRNA相對表達量也顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。以上結果提示，枯草芽孢桿菌RZ001激活了乳鼠Wnt信號通路及靶基因的轉錄。

2.5 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸β-catenin蛋白相對表達量的影響

如圖7所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸β-catenin蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。以上結果表明，枯草芽孢桿菌RZ001促進β-catenin蛋白在細胞質中的積累，β-catenin隨后進入細胞核中激活Wnt信號通路靶基因的轉錄表達。

2.6 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道菌群相對豐度的影響

如表6所示，門水平上，與對照組相比，試驗組的乳鼠盲腸中擬桿菌門的相對豐度顯著增加(P<0.05)，而厚壁菌門的相對豐度顯著降低(P<0.05)。屬水平上，與對照組相比，試驗組的乳鼠盲腸中雙歧桿菌屬的相對豐度極顯著增加(P<0.01)，乳桿菌屬的相對豐度也有所增加，但差異不顯著(P>0.05)；而產氣莢膜梭菌的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，大腸桿菌的相對豐度也有所降低，但差異不顯著(P>0.05)。以上結果表明，枯草芽孢桿菌RZ001可以調控乳鼠腸道微生物群的相對豐度。

表5 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸絨毛形態結構的影響

圖3 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸杯狀細胞數量的影響(AB-PAS染色)

A：實時熒光定量PCR分析小腸中MUC2的mRNA相對表達量；B：ELISA法分析小腸中MUC2含量。

圖5 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠生長的影響

遺傳、品種、疾病、飼糧結構、飼養方式及環境濕度等因素都可以影響動物體重的增長。大量的研究結果表明，動物飼糧中添加一定量的益生菌制劑可以改善動物的生長性能[15]。枯草芽孢桿菌是一種在飼料工業及畜牧業中廣泛應用的益生菌。枯草芽孢桿菌對腸細胞具有很強的黏附性，通過消耗腸內氧氣在腸道微生態平衡中發揮重要作用，從而創造厭氧環境[16]。研究表明，枯草芽孢桿菌在胃腸道中的孢子萌發可以獨立進行，也可以與小腸中的其他腸道微生物聯合進行[17-18]。一些芽孢桿菌物種通過調節免疫功能來防止病原體感染，從而改善豬的腸道健康[19]。飼糧中添加枯草芽孢桿菌PB6能夠提高斷奶仔豬的生長速度、腸道發育和免疫功能[5]。本研究表明，枯草芽孢桿菌RZ001能夠顯著增加乳鼠早期的體重(出生后第2天到第8天)，同時顯著增加脾臟、腎臟、胸腺等器官指數，這些結果表明枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠的生長產生積極作用。

圖6 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸Wnt信號通路相關蛋白mRNA相對表達量的影響

圖7 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸β-catenin蛋白相對表達量的影響

3.2 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道發育的影響

小腸是動物機體消化與吸收營養物質的主要場所，小腸的消化吸收能力直接受到小腸絨毛長度和隱窩深度的影響[7]。絨毛長度增加，隱窩深度變淺，可以增加小腸與營養物質的接觸面積，進而增強小腸對營養物質的消化與吸收能力[4,15]。絨毛長度、絨毛長度/隱窩深度越高，說明小腸消化吸收能力強。已有研究發現動物飼糧中添加枯草芽孢桿菌可改善小鼠、斷奶仔豬、肉雞、肉牛、羔羊、鵝等動物的腸道黏膜形態，促進小腸絨毛發育。Li等[7]研究發現，連續18 d補充枯草芽孢桿菌可以改善15日齡小鼠的黏膜形態，增加絨毛與隱窩細胞的比例。研究發現，斷奶仔豬補充枯草芽孢桿菌可以顯著增加回腸絨毛長度，顯著降低回腸隱窩深度，極顯著增加回腸絨毛長度/隱窩深度[15,20]。鐘光等[21]研究發現，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著降低肉仔雞空腸的隱窩深度，改善肉雞空腸黏膜形態。本研究結果表明，乳鼠連續14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001后，小腸絨毛密度和絨毛長度顯著增加，而隱窩深度顯著降低，絨毛長度/隱窩深度顯著增加。

MUC2是腸上皮杯狀細胞產生的一種黏蛋白，它是腸上皮黏液層的主要結構成分，能夠保護腸上皮免受化學和微生物損傷。腸道黏液中MUC2分子受到破壞會增加腸黏膜通透性，進而腸道中的毒素和病原微生物與上皮細胞的接觸增加，導致嚴重的腸道損傷和炎癥反應[22]。Shen等[23]發現早產仔豬MUC2合成減少，腸黏膜屏障功能減弱，因而仔豬易患壞死性結腸炎。MUC2-/-小鼠因缺乏保護性黏膜屏障，使得宿主腸上皮直接與腸道菌群接觸，最終導致小鼠發生自發性結腸炎[24]。已有文獻證實枯草芽孢桿菌能增加小鼠[25]和肉雞[26]的MUC2含量，防止腸黏膜損傷，促進腸黏膜的修復。Zhang等[25]利用AB-PAS染色證實枯草芽孢桿菌處理的小鼠MUC2的mRNA相對表達量增加。飼糧添加枯草芽孢桿菌顯著提高了肉雞腸道中MUC2的mRNA相對表達量[26-27]。本研究結果表明，乳鼠連續14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001后小腸杯狀細胞數量顯著增加，小腸MUC2含量顯著提高。

緊密連接蛋白的形成對防止細菌和抗原細胞旁擴散具有重要意義，一些重要的上皮性緊密連接蛋白，如ZO-1、Ocln和Cldn-3，有助于維持腸上皮屏障的完整性，對腸黏膜損傷的修復和腸道健康具有重要意義[28]。Gong等[29]發現枯草芽孢桿菌通過上調閉合蛋白-1(claudin-1)、Ocln、連接黏附分子-A(JAM-A)和ZO-1等緊密連接蛋白的表達改善小鼠腸道屏障功能，減少腸道上皮損傷，減輕DSS誘導的結腸炎。枯草芽孢桿菌HB3通過促進緊密連接蛋白表達從而改善豬上皮屏障功能[30]。本研究發現，乳鼠連續14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001提高了小腸中ZO-1、Ocln、Cldn-3的mRNA相對表達量，表明枯草芽孢桿菌RZ001能在早期提高乳鼠小腸緊密連接的形成以及改善腸屏障功能。這些結果表明，枯草芽孢桿菌RZ001能夠促進腸屏障功能的成熟。

表6 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道菌群相對豐度的影響

3.3 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠Wnt信號通路介導的上皮細胞生長分化的影響

典型Wnt/β-catenin信號通路對腸隱窩基底部ISCs的存活和維持具有重要意義。腸道隱窩的分裂是由Wnt信號介導的，用Wnt激動劑局部治療可促進腸道生長。Wnt3是一種經典的Wnt信號配體，與受體Fzd7和共受體Lrp5/6結合，阻止β-catenin在細胞質中的降解，從而積聚并轉運到細胞核[31]。隨后，靶基因Lgr5、C-myc、Axin2和Atoh1被轉錄激活[32]。本研究證實，乳鼠連續14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001顯著上調了乳鼠小腸Wnt3、Fzd7、Lrp5、Gsk-3β、Ctnnb1、C-myc、Axin2和Atoh1的mRNA相對表達量。此外，枯草芽孢桿菌RZ001也能夠增加小腸β-catenin的蛋白相對表達量。這些結果表明，枯草芽孢桿菌RZ001可能通過激活Wnt信號通路促進腸道發育，且Lrp5可能是一個必需的共受體。近年來，一些學者報道了其他益生菌對腸道發育和ISCs生長分化的影響。新生小鼠體內鼠李糖桿菌GG(LGG)定植促進腸上皮細胞增殖和分化[33]。乳桿菌D8通過加速ISCs再生從而保護腸黏膜的完整性，改善DSS誘導的腸黏膜損傷[34]。雙歧桿菌和乳酸桿菌促進ISCs的增殖以及腸上皮細胞的再生[9]。而枯草芽孢桿菌是否能影響腸道干細胞的生長分化，是否能激活Wnt信號通路目前尚未見相關報道。在本研究中，乳鼠連續14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001可增加小腸組織中ISCs標記物Lgr5和Ki67的mRNA相對表達量，暗示其促進新生小鼠腸道發育、腸道屏障成熟和細胞增殖的作用可能是通過激活Wnt信號通路進而促進ISCs介導的上皮細胞生長分化而實現的。

3.4 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道菌群的影響

腸道微生物的早期定植是維持和調節腸道屏障功能的必要條件[35]。腸道共生菌群通過促進上皮細胞增殖以及改善腸上皮完整性參與屏障功能的維持[36]。本研究發現，乳鼠連續14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001能夠增加乳鼠盲腸中擬桿菌門、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對豐度，降低厚壁菌門、大腸桿菌和產氣莢膜梭菌的相對豐度。與本研究結果相似，Yang等[37]研究發現補充枯草芽孢桿菌KT260179顯著增加了昆明小鼠盲腸中有益細菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量，而顯著減少了條件致病菌大腸桿菌的數量。枯草芽孢桿菌18可以增加小鼠腸道中乳酸桿菌的數量[7]。已有報道證實乳酸桿菌和雙歧桿菌產生的乳酸可以通過激活Paneth和腸基質細胞中的Wnt/β-catenin信號通路促進ISCs介導的上皮細胞的發育[34]。而枯草芽孢桿菌RZ001可以增加乳酸產生菌的相對豐度，這可能是其發揮作用的主要原因。因此，枯草芽孢桿菌RZ001可能通過增加乳酸產生菌在腸道內的早期定植，促進ISCs介導的腸上皮發育和成熟。

4 結 論

早期應用枯草芽孢桿菌RZ001能夠促進乳鼠生長，改善腸道形態，促進腸道屏障功能成熟，從而促進早期腸道發育。早期應用枯草芽孢桿菌RZ001還能夠激活乳鼠的Wnt信號通路，降低腸道致病菌產氣莢膜梭菌的相對豐度，增加腸道益生菌雙歧桿菌屬的相對豐度。

致謝：

感謝天津藍海蘭母嬰家政服務有限公司開發區分公司提供的新生兒糞便樣本。