添加乳酸菌、糖蜜和無機酸對羊草青貯飼料發酵品質及體外干物質消失率的影響

黃秋連 周 昕 王 健 張嘉賓 曹 陽

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江省寒區飼料資源高效利用與營養調控重點實驗室，糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，大慶163319)

羊草(Leymuschinensis)為禾本科多年生冷季型牧草，廣泛生長于亞洲北溫帶地區，是中國北方、蒙古高原、西伯利亞西部和東部的主要天然牧草[1]，具有適應性強、產量高、富含蛋白質等特點。目前我國大部分地區通常將羊草加工成干草產品[2]。但是，在黑龍江絕大多數地區，在羊草的收獲季節，晾曬時正逢雨季，常常遭受雨淋，導致營養物質流失和發霉變質[3]，調制干草較困難，因此青貯方式是貯藏羊草更有效的措施，能避免因雨淋導致營養成分的流失[4]。但由于羊草的水溶性碳水化合物(WSC)含量較低，難以調制出優質青貯飼料，需要進行添加劑青貯。

通常在乳酸菌數量至少達到105CFU/g FM時，才能保證牧草良好的發酵品質并得以長期保存[5]。然而大多數牧草附著的乳酸菌數量均低于105CFU/g FM，因此需要添加外源乳酸菌來獲得優質青貯飼料。20世紀70年代就已證明添加乳酸菌有益于青貯飼料的發酵，特別是同型發酵乳酸菌，可以確保牧草青貯以乳酸發酵為主導，從而提高牧草的發酵品質[6-7]。Cai等[5,8-9]研究表明，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Chikuso-1是一種很有潛力的全株水稻青貯乳酸菌添加劑。Cao等[10-11]報道，與對照組相比，LactobacillusplantarumChikuso-1處理的青貯飼料pH降低，乳酸含量和干物質消失率提高。李苗苗等[12]將乳酸菌添加到油莎草青貯中，可有效地改善油莎草青貯發酵品質，提高其營養價值。糖蜜可為乳酸菌提供更多的發酵底物，使乳酸發酵迅速占據主導地位，已作為一種綠色、安全的發酵促進劑被廣泛使用。Alli等[13]報道，銀合歡青貯過程中添加糖蜜可以降低pH，減少干物質損失，增加乳酸和水溶性碳水化合物含量。靳思玉等[14]研究顯示，添加糖蜜可以提高油莎草的青貯發酵品質和黃酮含量。在新鮮牧草青貯初期，由于pH較高，并有部分氧氣存在，植物表面附著的好氧性微生物活躍，消耗青貯原料中的養分[11]，因此如何迅速降低pH，抑制好氧性微生物的活性，減少養分損失，對于成功青貯至關重要。張志登等[15]研究發現，添加無機酸可提高黃貯玉米秸稈發酵品質和體外干物質消失率，減少甲烷生成量。靳思玉等[16]報道，苜蓿青貯時添加無機酸，可以抑制有害微生物的增殖，顯著提高苜蓿青貯發酵品質。

本試驗采用小規模發酵法，以羊草為原料，研究乳酸菌、糖蜜、無機酸作為青貯添加劑對羊草青貯飼料營養成分含量、發酵品質及體外瘤胃干物質消失率的影響，為優質羊草青貯飼料的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用羊草的供給地為黑龍江省大慶市天然草場，羊草鍘短至1～2 cm，水分含量調整為60%；青貯添加劑：乳酸菌制劑(LactobacillusplantarumChikuso-1)，由日本某研究所提供，活菌數約為105CFU/g；糖蜜：由成都某商貿有限公司提供，總糖(蔗糖+還原糖)含量≥40%，波美度(°Bé)≥33.333；無機酸：由1 mol/L H2SO4和2 mol/L HCl以體積比4∶1混合而成的混合酸。

1.2 試驗設計

采用單因子完全隨機設計，在羊草青貯時設置5個處理：1)無添加(C組，作為對照組)；2)添加0.000 25%乳酸菌(LAB組)；3)添加4%糖蜜(M組)；4)添加4%無機酸(IA組)；5)添加0.000 25%乳酸菌+4%糖蜜(LAB+M組)。青貯添加劑的添加量均為鮮重基礎，每個處理設置3個重復，將羊草與青貯添加劑混勻后裝入16 cm×25 cm聚乙烯袋(每袋約200 g)，抽真空密封，室溫下保存120 d后開封取樣分析。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 感官品質

開封后鑒定羊草青貯飼料的顏色、氣味、質地、霉變等感官品質，判定標準參考文獻[17]。

1.3.2 發酵品質

1.3.3 微生物培養及計數

稱取10 g羊草青貯飼料，與90 mL蒸餾水混勻過濾，在無菌操作環境中，用蒸餾水將浸出液從10-1連續梯度稀釋到10-5備用。乳酸菌采用MRS肉湯培養基(30 ℃厭氧，48 h)，梭菌孢子采用Clostridia Count Agar培養基(30 ℃厭氧，48 h)，霉菌和酵母菌采用Potato Dextrose Agar培養基(30 ℃，48 h)，好氧性細菌和芽孢桿菌采用Nutrient Agar培養基(30 ℃，48 h)，大腸桿菌采用Blue Light Broth培養基(30 ℃，48 h)培養后，采用平板菌落計數法計算各菌落總數，用每克新鮮樣品中菌落形成單位的對數表示[lg(CFU/g FM)][20]。所用培養基均由青島海博生物有限公司提供。

1.3.4 體外瘤胃發酵參數

用2個裝瘤胃瘺管的成年羯羊(平均初始體重32.0 kg)作為瘤胃液供體。飼料供應參照《肉羊飼養標準》(NY/T 816—2004)，每天06:00和18:00分別飼喂1次，自由飲水[12]。飼喂后2 h經瘤胃瘺管取瘤胃液，4層紗布過濾后，以相同的體積混合轉入塑料瓶。將混合后的濾液通入CO2氣體，以1∶4的體積比與McDougal緩沖液(pH 6.8)混合形成瘤胃緩沖液，然后將50 mL瘤胃緩沖液轉移到128 mL的含0.5 g羊草青貯飼料樣品的血清瓶中，通入CO2氣體排出空氣。用丁基橡膠塞和鋁蓋將血清瓶密封后于恒溫培養振蕩搖床(39 ℃，100 r/min)培養48 h后，測定pH、產氣量、干物質消失率[10]。所用儀器及設備均由黑龍江省寒區飼料資源高效利用與營養調控重點實驗室提供。

1.3.5 營養成分含量

將剩余的羊草青貯飼料于電熱恒溫鼓風干燥箱(65 ℃，48 h)烘至恒重后，粉碎并過2 mm篩后分析營養成分。采用AOAC(1990)[19]的934.01、976.05、920.39和942.05方法，分析干物質(dry matter，DM)、粗蛋白質(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(Ash)含量。參照Van Soest等[21]的方法，分析中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量。

1.4 數據分析與統計

試驗數據采用Excel 2010計算與整理后，使用SAS 9.4進行方差分析，并用Tukey法進行多重比較，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 羊草青貯飼料的感官品質

由表1可知，對照組的羊草青貯飼料以黃褐色為主，各添加劑組均為黃綠色；各添加劑組的羊草青貯飼料比對照組的酸味更濃；各組羊草青貯飼料總體為質地柔軟、濕潤不黏手、無霉變。

表1 羊草青貯飼料的感官品質

2.2 青貯前羊草及其經不同處理青貯后的營養成分含量

由表2可知，試驗所用羊草青貯前DM、CP、EE、NDF、ADF、Ash含量分別為34.10%、7.90%、2.23%、66.16%、29.95%和6.99%。添加不同青貯添加劑進行青貯后，M組和LAB+M組的DM含量顯著高于對照組(P<0.05)；IA組的CP含量顯著高于其他各組(P<0.05)；LAB+M組的NDF含量顯著低于其他各組(P<0.05)；各添加劑組的ADF含量均顯著低于對照組(P<0.05)；各組間EE和Ash含量無顯著差異(P>0.05)。

表2 青貯前羊草及其經不同處理青貯后的營養成分含量

2.3 羊草青貯飼料的發酵品質

由表3可知，各添加劑組pH均顯著低于對照組(P<0.05)，其中IA組pH最低，為4.41；LAB+M組的乳酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)；與對照組相比，所有添加劑組的氨態氮/總氮都有不同程度的下降，其中M組和IA組的氨態氮/總氮顯著低于其他各組(P<0.05)；各組均未檢出丁酸。

表3 羊草青貯飼料的發酵品質

2.4 羊草青貯飼料的微生物數量

由表4可知，各添加劑組的乳酸菌數量均顯著高于對照組(P<0.05)，其中LAB+M組的乳酸菌數量最高；LAB組的芽孢桿菌數量顯著低于其他各組(P<0.05)；M組的酵母菌數量最高，且顯著高于對照組和LAB組(P<0.05)；各組間好氧性細菌數量均無顯著差異(P>0.05)，且均未檢出大腸桿菌、梭菌和霉菌。

表4 羊草青貯飼料的微生物數量

2.5 羊草青貯飼料的體外瘤胃發酵參數

由表5可知，各組pH無顯著差異(P>0.05)；除M組外，其他添加劑組與對照組相比產氣量均出現不同程度的增加，其中LAB+M組的產氣量最高；LAB+M組的體外干物質消失率顯著高于對照組和LAB組(P<0.05)。

表5 羊草青貯飼料的體外瘤胃發酵參數

3 討 論

本試驗中，各組羊草青貯飼料均表現為質地柔軟、水分適宜、有濃厚酸味，相較于羊草原料本身，其質地和適口性得到明顯改善。其中，對照組為黃褐色，各添加劑組均為黃綠色，且各添加劑組的酸香味也比對照組更濃厚，符合優質青貯飼料的感官評定標準[22]。

乳酸菌在青貯發酵中起著重要作用，乳酸菌數量已成為預測青貯飼料發酵的充分性和決定青貯飼料是否添加外源乳酸菌的重要因素。本試驗所用的乳酸菌菌株為LactobacillusplantarumChikuso-1，該菌株能促進乳酸發酵，在低pH環境下生長良好[11]。因此，用該菌株制備青貯飼料可以促進乳酸菌的增殖，降低pH，抑制梭菌和其他微生物的生長，使青貯飼料的品質得以提高[5]。在本試驗中，添加乳酸菌組與對照組相比，乳酸含量增加，pH顯著降低，氨態氮/總氮降低，未檢測出大腸桿菌、梭菌和霉菌，這是因為添加乳酸菌增加了青貯發酵初期的乳酸菌數量，彌補了原料中乳酸菌數量的不足，很快進入乳酸發酵階段，pH迅速下降，有害微生物的活性被抑制[23]。

糖蜜所含的WSC可以被乳酸菌直接利用，添加到青貯中可以促進青貯早期乳酸菌的繁殖，快速達到穩定的青貯發酵階段，抑制其他雜菌對發酵底物的消耗和蛋白質的水解。吳金彩等[24]添加不同水平糖蜜青貯全株“張雜谷”，結果表明4%糖蜜組的各項發酵指標較好。孫肖慧等[25]報道，紫花苜蓿和燕麥以3∶7混合后添加4%糖蜜青貯，可使丁酸含量和氨態氮/總氮顯著降低。本研究結果顯示，添加4%糖蜜制備的羊草青貯飼料的pH、ADF含量和氨態氮/總氮降低，CP含量增加，與吳金彩等[24]和孫肖慧等[25]研究結果一致；同時，添加糖蜜組的酵母菌數量不同程度高于其他各組，這是由于添加糖蜜后，殘留的WSC和乳酸含量相對較高，而這2種物質被用作酵母菌的底物[26]。與對照組相比，添加糖蜜組的乳酸含量沒有顯著增加，而添加乳酸菌+糖蜜組乳酸含量顯著增加，與Cao等[10]的報道一致，這可能是因為即使不添加糖蜜，羊草青貯中也有足夠的可發酵糖，乳酸菌可能已經將更多的可發酵糖轉化為乳酸。

酸處理可使飼料pH迅速下降，達到適于乳酸菌生長繁殖的條件，同時抑制有害菌的繁殖。張志登等[15]添加4%無機酸黃貯玉米秸稈，靳思玉等[16]添加8%無機酸青貯紫花苜蓿，結果表明4%和8%無機酸的添加均可使pH顯著下降，抑制有害微生物的生長，提高青貯飼料發酵品質。本試驗研究結果與上述研究結果相似，同時本試驗中添加無機酸組的氨態氮/總氮顯著低于對照組，CP含量顯著高于其他組，這是由于pH的迅速降低有效地抑制了植物酶和微生物水解蛋白酶的活性，進而使蛋白質的降解和后期游離氨基酸的分解減少。

添加乳酸菌+糖蜜組的DM和乳酸含量顯著高于其他組，這可能是由于兩者的加入不僅補充了發酵底物，也增加了乳酸菌數量，促進了青貯早期乳酸菌的增殖，從而使乳酸菌能夠生產更多的乳酸，使pH迅速下降，抑制有害微生物增殖，減少了營養成分的損失[27]。

瘤胃液pH可以反映瘤胃內部環境與發酵程度，微生物的活動和繁殖要求環境保持一定的pH，其正常變化范圍為5.5～7.5[28]。本研究中，體外培養液的pH均處于此范圍內，為6.78～7.21，不會影響微生物的活力。飼料體外發酵產氣的底物主要是碳水化合物，產氣量可以反映瘤胃微生物利用底物的程度，也可以體現飼料營養價值的高低[29]。程鵬輝等[30]研究表明，產氣量越大，牧草發酵品質越好。體外干物質消失率反映發酵體系中微生物降解飼料的程度[12]。本試驗中，羊草青貯飼料的體外產氣量和干物質消失率最大的均為添加乳酸菌+糖蜜組，可見同時添加乳酸菌和糖蜜時羊草青貯飼料的發酵品質和營養價值最好。

4 結 論

本試驗所使用的青貯添加劑均能在不同程度上改善羊草青貯飼料的發酵品質和體外干物質消失率，綜合考慮，以同時添加乳酸菌和糖蜜的效果最好。