飼糧中添加不同比例黃芪副產物對綿羊脾臟中Toll樣受體2和白細胞介素-1受體相關激酶4表達的影響

王 霞 陳智麗 馬煥交 李討討 劉 婷 馬友記,3*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州730070；2.新疆哈密市伊吾縣林業和草原局，哈密839300；3.甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，民勤733300)

近年來，隨著依賴中草藥為原料的大健康產業的迅猛發展，中藥材生產及加工過程中產生了大量的非藥用部位及副產物，造成極大的資源浪費和環境承載壓力。研究發現，這些未被利用的副產物中多富含具有增強免疫力、抗菌消炎、助消化的可飼用資源性物質，可作為畜禽用藥及飼料添加劑的原料加以利用[1]。黃芪為中醫藥常用藥材之一，其有效成分主要包括黃芪多糖、黃芪黃酮和黃芪皂苷，在提高機體免疫力、抗菌、抗病毒和抗氧化等方面發揮重要作用[2]。已有研究表明，飼糧中添加黃芪能提高動物的生產性能和機體的免疫力，是一種理想的綠色飼料添加劑[3-4]。

脾臟是機體最大的免疫器官，在系統性免疫應答中發揮至關重要的作用。現代中醫藥研究結果表明，黃芪多糖可以激活Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)介導的髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴的信號通路來調節宿主的免疫應答反應[5]。TLR是免疫細胞中最上游的模式識別受體，可檢測病原體相關的分子模式，啟動信號轉導。白細胞介素-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK)家族可介導TLR和白細胞介素-1受體(interleukin-1 receptor，IL-1R)的激活信號[6-7]。TLR2和IRAK4是TLR2/MyD88/核轉錄因子-κB(NF-κB)免疫信號通路上起著重要免疫調控作用的基因[8]。TLR家族內含有很多成員，目前在哺乳動物中至少鑒定到13個成員，TLR2是其中之一[9]。IRAK家族由4個成員組成：IRAK1、IRAK2、IRAK-M和IRAK4，這些家族成員在先天免疫、適應性免疫調節中具有重要作用[10]。然而，目前關于黃芪副產物對機體免疫機能影響的報道較少，為了探究飼糧中添加不同比例黃芪副產物對機體免疫機能的影響，本研究測定了綿羊的免疫器官指數，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot技術檢測了綿羊脾臟組織中TLR2和IRAK4的mRNA和蛋白的相對表達量，并運用免疫組織化學染色技術檢測了TLR2和IRAK4蛋白在綿羊脾臟中的定位，以期了解黃芪副產物在綿羊脾臟免疫調控中的作用，為進一步研究黃芪副產物對機體免疫調控的機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用黃芪副產物為制作黃芪飲片所產生的下腳料，購自某醫藥公司。黃芪副產物經風干粉碎過40目篩。以葡萄糖、蘆丁、黃芪甲苷標準品制備標準曲線，利用比色法測得黃芪副產物中黃芪總多糖、總皂苷及總黃酮含量分別為13.94、0.82和1.35 mg/g。經測定，黃芪副產物營養水平見表1。

表1 黃芪副產物營養水平(干物質基礎)

1.2 試驗設計與飼養管理

試驗選擇體況良好、健康、體重[(27.43±3.61) kg]相近的3月齡澳洲白與湖羊雜交F1公羔68只，隨機分為4組，每組17只羊。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組分別在基礎飼糧中添加2%(2%組)、4%(4%組)、6%(6%組)的黃芪副產物。基礎飼糧組成及營養水平見表2。飼養試驗在甘肅省蘭州市眾泰養殖有限公司進行，預試期10 d，正試期60 d。試驗動物分組混合飼喂，每日喂料2次，08：00和17：00各飼喂1次，自由采食，自由飲水，定期免疫驅蟲。

1.3 指標測定及樣品采集

黃芪副產物及飼糧中干物質、粗灰分、粗脂肪、粗蛋白質、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣和磷含量分別參照GB/T 6435—2014[13]、GB/T 6438—1992[14]、GB/T 6433—2006[15]、GB/T 6432—1994[16]、GB/T 20806—2006[17]、NY/T 1459—2007[18]、GB/T 6437—2002[19]和GB/T 6436—2002[20]的方法測定。

在試驗初始和結束當天早晨對各組試驗羊空腹稱重，計算試驗羊的平均日增重。試驗期間，每天分組記錄試驗羊的日飼喂量和剩料量，計算平均干物質采食量[21]。試驗期結束后每組選取3只羊，頸靜脈放血處死，收集脾臟組織稱其重量，計算脾臟指數。稱重后迅速采集脾臟組織，將一部分脾臟組織樣品放入高壓處理過的1.5 mL EP管后迅速投于液氮中，之后轉入-80 ℃冰箱保存用于提取組織總RNA和總蛋白；另一部分脾臟組織樣品放入4%的多聚甲醛溶液中固定后用于制備石蠟組織切片。

表2 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

續表2項目 Items含量 Content營養水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)12.25代謝能 ME/(MJ/kg)9.81干物質 Dry matter90.17粗脂肪 Ether extract2.65粗蛋白質 Crude protein14.39中性洗滌纖維 Neutral detergent fiber26.35酸性洗滌纖維 Acid detergent fiber14.66鈣 Calcium1.59磷 Phosphorus1.34

1.4 試驗方法

1.4.1 總RNA提取與cDNA合成

使用Trizol試劑提取脾臟組織總RNA，用超微量分光光度計(Thermo Scientific，德國)檢測總RNA濃度和純度，然后按照反轉錄試劑盒(北京迪寧生物有限公司)的說明合成第1鏈cDNA。

1.4.2 qRT-PCR

從NCBI數據庫下載綿羊TLR2、IRAK4和β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA序列，使用軟件Oligo 6.0設計引物，然后用Blast軟件對引物的特異性進行檢測。引物由西安擎科生物公司合成，引物序列信息見表3。qRT-PCR擴增體系為20 μL，包括：上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2×Fast qPCR Master Mixture (Green) 10 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL；擴增條件為：95 ℃ 120 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。

1.4.3 Western Blot

用RIPA高效組織裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離變性的蛋白，然后將凝膠上的蛋白轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封閉2 h后分別加入兔源一抗TLR2(1∶1 000，北京博奧森生物公司)、IRAK4(1∶1 000，北京博奧森生物技術有限公司)和β-actin(1∶1 500，北京博奧森生物技術有限公司)，4 ℃孵育過夜。PBST洗膜后加入二抗(1∶5 000，北京博奧森生物技術有限公司)37 ℃孵育2 h。PBST洗膜后，在X光室中使用底物化學發光試劑(electrochemi-luminescence，ECL)對蛋白的陽性信號進行可視化。

表3 引物序列信息

1.4.4 免疫組織化學染色

將石蠟切片65 ℃烤片3～5 h后，進行脫蠟、脫水、抗原修復處理。按照免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)的操作說明滴加3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育抑制內源性過氧化物酶的活性；用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加試劑A(封閉液)室溫封閉30 min，甩掉試劑A，滴加一抗TLR2(1∶500)和IRAK4(1∶250)4 ℃過夜，用PBS代替一抗作陰性對照。PBS洗滌后滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水終止后脫水、透明、封片、鏡檢照相。

1.5 數據統計分析

采用2-ΔΔCt方法[22]計算TLR2和IRAK4的mRNA的相對表達量。用AlphaEaseFC圖像分析軟件掃描TLR2和IRAK4蛋白的灰度。采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，結果用平均值±標準差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 飼糧中添加不同比例黃芪副產物對綿羊生長性能的影響

由表4可知，在綿羊飼糧中添加不同比例的黃芪副產物后，各組綿羊的終末體重、平均日增重和平均干物質采食量差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼糧中添加不同比例黃芪副產物對綿羊生長性能的影響

2.2 飼糧中添加不同比例黃芪副產物對綿羊脾臟指數的影響

由表5可知，在綿羊飼糧中添加不同比例的黃芪副產物后，2%組綿羊的脾臟指數顯著高于對照組、4%組和6%組(P<0.05)，而4%組和6%組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)。

表5 飼糧中添加不同比例黃芪副產物對綿羊脾臟指數的影響

2.3 飼糧中添加不同比例黃芪副產物對綿羊脾臟中TLR2和IRAK4的mRNA相對表達量的影響

由圖1可知，TLR2和IRAK4的mRNA在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟中均有表達，且表達趨勢相似，其mRNA相對表達量隨著黃芪副產物添加比例的增加而降低。2%組TLR2的mRNA相對表達量顯著高于對照組、4%組和6%組(P<0.05)，對照組、4%組和6%組之間差異不顯著(P>0.05)。2%組IRAK4的mRNA相對表達量顯著高于對照組、4%組和6%組(P<0.05)；4%組IRAK4的mRNA相對表達量顯著高于6%組(P<0.05)，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；6%組IRAK4的mRNA相對表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)。

數據柱標注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

2.4 飼糧中添加不同比例黃芪副產物對綿羊脾臟中TLR2和TLR4蛋白相對表達量的影響

由圖2可知，TLR2和IRAK4蛋白在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟中均有表達，且呈現出與mRNA相似的表達趨勢。2%組TLR2蛋白相對表達量最高，且顯著高于對照組、4%組和6%

組(P<0.05)，4%組和6%組顯著高于對照組(P<0.05)。2%組IRAK4蛋白相對表達量最高，且顯著高于對照組、4%組和6%組(P<0.05)；4%組IRAK4蛋白相對表達量顯著高于對照組和6%組(P<0.05)，6%組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 飼糧中添加不同比例黃芪副產物對綿羊脾臟中TLR2和IRAK4蛋白相對表達量的影響

2.5 TLR2和IRAK4蛋白在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟中的定位

由圖3可知，運用免疫組織化學染色的方法檢測TLR2和IRAK4蛋白在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟中的定位，結果發現，TLR2蛋白的免疫陽性信號主要定位在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟紅髓的脾竇中，IRAK4蛋白的免疫陽性信號主要定位在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟紅髓的脾索中，且2%組的免疫陽性信號較高。

A1～A4：對照組、2%組、4%組和6%組脾臟中TLR2蛋白的免疫組織化學染色結果(400×)；B1～B4：對照組、2%組、4%組和6%組脾臟中IRAK4蛋白的免疫組織化學染色結果(400×)；C1～C4：對照組、2%組、4%組和6%組陰性對照(400×)；C：脾索，S：脾竇。

3 討 論

黃芪藥材生產過程中產生的副產物具有較高的營養物質，其含有與其藥用部位相似的化學組分[23]。黃芪的有效成分主要是黃芪多糖，黃芪多糖可以通過調節宿主免疫器官、免疫細胞及免疫分子，促進特異性與非特異性免疫以及多種信號通路作用，增強機體免疫力[24]。研究發現，飼糧中添加一定比例的黃芪可以促進動物生長發育、增加免疫器官質量、提高免疫器官指數、改善抗氧化能力和增強機體免疫力[25]。體增重是衡量綿羊生長性能的重要指標。本試驗結果發現，綿羊飼糧中添加不同比例的黃芪副產物后各組羔羊的平均日增重和平均干物質采食量差異不顯著，這表明飼糧中添加不同比例的黃芪副產物對綿羊生長發育無顯著影響。免疫器官的重量是反映機體非特異性免疫功能的重要指標，脾臟指數能反映免疫器官的發育和免疫細胞的功能狀況[26]。馬發順等[27]研究發現，飼糧中添加黃芪多糖可以顯著提高免疫器官指數。本試驗結果表明，飼糧中添加2%黃芪副產物可顯著提高綿羊的脾臟指數，飼糧中添加4%和6%黃芪副產物對綿羊的脾臟指數無顯著影響，這表明基礎飼糧中添加2%的黃芪副產物可以促進機體免疫器官發育。

TLR信號通路在先天免疫系統中發揮重要的作用。研究發現，IRAK4是調控IRAK1生物活性以及其他信號轉導的關鍵分子，在TLR介導的信號通路中起重要的免疫調控作用[28]。研究表明，營養物質可以調控TLR信號通路相關基因的表達水平[29-30]。王海鷹[31]研究發現，靈芝多糖可以通過TLR2通路來激活NF-κB信號。韓乾杰[32]研究表明，黃芪多糖可以提高斷奶仔豬生長性能，增強仔豬免疫功能，并通過調節腸道TLR4/NF-κB信號通路緩解機體過度免疫應激。為了探究飼糧中添加不同比例黃芪副產物是否調控TLR2信號通路相關基因的表達水平，本研究檢測了TLR2和IRAK4 mRNA在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟中的相對表達量，結果顯示，TLR2和IRAK4 mRNA在所有檢測的綿羊脾臟組織中均有表達，飼喂黃芪副產物的綿羊脾臟中TLR2和IRAK4的mRNA相對表達量均高于對照組，且以2%組最高，其表達量隨著黃芪副產物添加比例的增加而降低。對飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟中TLR2和IRAK4蛋白表達進行檢測，結果發現，TLR2和IRAK4蛋白的表達趨勢與mRNA的表達趨勢一致，2%組TLR2和IRAK4蛋白的相對表達顯著高于對照組，隨著黃芪副產物添加比例的升高，其表達量呈降低趨勢，與楊茹茜[33]的研究結果基本一致。本試驗結果表明，飼糧中添加一定比例的黃芪副產物可以增加機體TLR2和IRAK4的mRNA相對表達量，且添加比例為2%時的效果最好。王憲舉等[34]的研究發現，黃芪添加量過高時會導致動物采食過多次生功能性物質，從而抑制家畜營養利用。Guo等[35]在鵪鶉飼糧中添加1%、3%和5%的黃芪莖葉，結果發現飼糧中添加3%的黃芪莖葉在整個試驗期間能顯著提高平均日增重和平均日采食量，并促進免疫器官發育。這些研究結果表明飼糧中添加適宜比例的黃芪可以促進機體生長發育和提高免疫力，而添加過量的黃芪會對機體造成負影響[36]。本試驗隨著黃芪副產物添加比例的增加綿羊脾臟指數以及TLR2和IRAK4的mRNA相對表達量呈降低趨勢，這可能是隨著黃芪副產物添加比例的增加，綿羊采食過多次生功能性物質，抑制了營養利用，對機體造成了負影響。

TLR是一類普遍存在于天然免疫系統中的模式識別受體，通常表達于巨噬細胞、樹突細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的表面[37]。研究發現，黃芪多糖能增加巨噬細胞的數量，增強巨噬細胞的吞噬作用，提高自然殺傷細胞的活性[38-39]。通過細胞定位發現，TLR2蛋白的免疫陽性信號主要分布在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟紅髓脾竇中，IRAK4蛋白的免疫陽性信號主要分布在飼喂不同比例黃芪副產物綿羊脾臟紅髓脾索中，其中2%組的免疫陽性信號較高。脾臟是機體最大的外周免疫器官，主要由3部分組成：白髓、紅髓和邊緣區，每一部分都含有大量的免疫細胞[40]。研究發現，植物多糖可通過與免疫細胞表面的多種受體結合，激活不同的信號通路來調控動物機體的免疫系統，其中TLR2可以結合糖基配體，介導免疫細胞激活細胞內信號通路，參與免疫調節[41]。據此推測，黃芪副產物對機體免疫機能的調控可能是通過與紅髓內免疫細胞的受體TLR2結合激活信號通路，刺激下游IRAK4基因的表達，從而發揮免疫調節作用。但是，黃芪副產物對機體具體免疫機制尚需進行更深入的探究。

4 結 論

基礎飼糧中添加2%的黃芪副產物不僅可以增加綿羊的脾臟指數，還可以上調脾臟中TLR2和IRAK4基因的表達，從而在機體的免疫調節中發揮作用。